- Thử nghiệm vô khuẩn
2.1.2.2. Thửnghiệm kiểm tra Mycoplasma
Dụng cụ và trang thiết bị
- Hốt vô trùng (Microflow) - Pipet aid (Thermo)
- Tủ ấm (Memmert) - Pipet 2ml, 5ml, 10ml (Corning)
- Kính hiển vi đảo pha (Olympus)
Vật liệu và hóa chất
- Môi trường PPLO lỏng, PPLO thạch (Vabiotech) - Mẫu thử: Nước nổi nuôi cấy tế bào; chủng giống EV71
Các bước tiến hành
Mẫu thử
* Môi trường lỏng: cấy trực tiếp 0,2ml mẫu thử vào mỗi ống môi trường. Mỗi loạt mẫu thử cấy trên 5 ống môi trường lỏng.
- Thể tích cấy: 0,2ml mẫu thử/ 1 ống môi trường.
* Môi trường đặc: 0,2 ml mẫu thử/ 1 đĩa thạch. Mỗi loạt mẫu thử cấy trên 5 đĩa thạch. Dùng giấy parafilm bao quanh rìa đĩa thạch để tránh khô mặt thạch.
Chứng môi trường
- Chứng âm: để nguyên ống hoặc đĩa môi trường, không mở.
- Chứng dương: Lấy kết quả kiểm tra chất lượng môi trường làm chứng dương.
Thời gian và nhiệt độ nuôi cấy: Nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ± 10
C trong 21 ngày.
Cấy chuyển: Đến ngày thứ 7, cấy chuyển từ ống môi trường lỏng sang môi
trường thạch: Hút 0,2 ml môi trường lỏng cấy vào 1 đĩa thạch. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ± 10
C / 21 ngày.
Theo dõi sau cấy
- Môi trường PPLO (môi trường lỏng và thạch) sau cấy được theo dõi và ghi kết quả vào Nhật ký kiểm định vào các ngày 3, 5, 7, 14 và 21.
- Đọc kết quả vào ngày thứ 21.
+ Môi trường lỏng: Quan sát sự đổi màu của môi trường. Nếu ống nào có sự chuyển màu (từ màu hồng nhạt chuyển sang màu vàng cam): cấy chuyển ra thạch để kiểm tra khuẩn lạc.
+ Môi trường đặc: Quan sát khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên các đĩa thạch dưới kính hiển vi: khuẩn lạc nhỏ, vùng trung tâm khuẩn lạc có màu sẫm và dày, rìa khuẩn lạc mỏng và bẹt trông như quả trứng ốp-lết.
Kết quả
Giá trị của thử nghiệm
- Loạt môi trường PPLO (lỏng và thạch) dùng cho thử nghiệm Mycoplasma phải đạt yêu cầu về kiểm tra chất lượng môi trường.
- Mẫu thử: không có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi trên cả 2 loại môi trường (lỏng và đặc).
- Đối với ống chứng:
. Chứng (-): Không có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi. . Chứng (+): Có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi.