Pha virut theo nồng độ 0.01TCID50/tế bào Rửa tế bào bằng dung dịch Hank’s Gây nhiễm virut đã pha theo nồng độ trên vào chai tế bào.

Một phần của tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 ở quy mô phòng thí nghiệm (Trang 59)

Hank’s. Gây nhiễm virut đã pha theo nồng độ trên vào chai tế bào.

- Hấp phụ ở nhiệt độ 36,5°C ± 0,5°C thời gian 50-70 phút. Thêm vào chai môi trường MEM. Nuôi cấy ở nhiệt độ 36,5°C ± 0,5°C, theo dõi tế bào, đánh giá sự hủy hoại tế bào bằng kính hiển vi đảo pha.

- Lọc vô trùng hỗn dịch virut bằng màng lọc 0,45m

-Chia hỗn dịch virut vào tuýp giữ chủng, dán nhãn. Bảo quản dưới - 60°C.

2.1.4. Kiểm tra chất lượng chủng giống gốc và chủng sản xuất Thử nghiệm vô khuẩn – Xem phần 2.1.2.1 Thử nghiệm vô khuẩn – Xem phần 2.1.2.1

Thử nghiệm kiểm tra Mycoplasma – Xem phần 2.1.2.2

Thử nghiệm kiểm tra các virút ngoại lai trên tế bào

Mẫu thử: Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh.

Tiến hành: – Xem phần 2.1.2.3

Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầuXem phần 2.1.2.4

2.1.4.1. Thử nghiệm kiểm tra các virút ngoại lai trên động vật thí nghiệm

Dụng cụ và trang thiết bị

- Bơm kim tiêm 1ml, 3ml, 5ml (Vinahankook) - Găng tay, bông vô trùng, cồn 70° (Việt Nam)

Vật liệu và hóa chất

- Chuột ổ dưới 24 giờ tuổi: 20 con

- Chuột Swiss trưởng thành 15-20 gam: 20 con - Chuột lang trưởng thành 350-450 gam: 5 con

- Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh

Tiến hành

Thử nghiệm trên chuột ổ dưới 24 giờ tuổi

* Mẫu thử: Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh

- Đường tiêm não: liều tiêm 0,01ml/con; 10 con - Đường tiêm ổ bụng: liều tiêm 0,1ml/con; 10 con

*Mẫu chứng: Không tiêm.

*Theo dõi sau tiêm: Theo dõi chuột hàng ngày trong 14 ngày sau tiêm.

Thử nghiệm trên chuột Swiss trưởng thành

* Mẫu thử: Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh

- Đường tiêm não: liều tiêm 0,03ml/con; 10 con - Đường tiêm ổ bụng: liều tiêm 0,5ml/con; 10 con

*Mẫu chứng: Không tiêm.

*Theo dõi sau tiêm: Theo dõi chuột hàng ngày trong 21 ngày sau tiêm.

Thử nghiệm trên chuột lang

* Mẫu thử: Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh

- Đường tiêm ổ bụng: liều tiêm 5 ml/con; 5 con

*Mẫu chứng: Không tiêm. *Theo dõi sau tiêm

- Theo dõi chuột hàng ngày trong 42 ngày sau tiêm. - Theo dõi nhiệt độ chuột 21 ngày đầu sau tiêm.

Kết quả

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Thử nghiệm đạt yêu cầu khi có ít nhất 80% chuột sống sót trong quá trình theo dõi.

+ Có ít nhất 80% chuột sống sót trong quá trình theo dõi.

+ Sau khi kết thúc quá trình theo dõi, mổ giải phẫu: các cơ quan ngũ tạng không có dấu hiệu bất thường.

2.1.4.2.Thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá virút TCID50

Dụng cụ và trang thiết bị

- Tủ ấm CO2 (Sanyo) - Pipet 10ml, 25ml vô trùng (Corning)

- Kính hiển vi đảo pha (Olympus) - Đầu típ 200µl, 1000µl (Corning)

- Máy trộn (Stuard) - Tuýp nhựa 1,5ml (Eppendorf)

- Pipet Aid (Thermo) - Phiến nuôi cấy tế bào 96 giếng (Nunc)

- Pipetman (Gilson) - Pipet đa kênh (Thermo)

Vật liệu và hóa chất

- Tế bào vero - Trypsin (Gibco)

- Môi trường MEM (Gibco) - Huyết thanh bê bào thai (Gibco) - Mẫu thử: Chủng giống EV71; hỗn dịch EV71

Tiến hành

Một phần của tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 ở quy mô phòng thí nghiệm (Trang 59)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(163 trang)