Hank’s. Gây nhiễm virut đã pha theo nồng độ trên vào chai tế bào.
- Hấp phụ ở nhiệt độ 36,5°C ± 0,5°C thời gian 50-70 phút. Thêm vào chai môi trường MEM. Nuôi cấy ở nhiệt độ 36,5°C ± 0,5°C, theo dõi tế bào, đánh giá sự hủy hoại tế bào bằng kính hiển vi đảo pha.
- Lọc vô trùng hỗn dịch virut bằng màng lọc 0,45m
-Chia hỗn dịch virut vào tuýp giữ chủng, dán nhãn. Bảo quản dưới - 60°C.
2.1.4. Kiểm tra chất lượng chủng giống gốc và chủng sản xuất Thử nghiệm vô khuẩn – Xem phần 2.1.2.1 Thử nghiệm vô khuẩn – Xem phần 2.1.2.1
Thử nghiệm kiểm tra Mycoplasma – Xem phần 2.1.2.2
Thử nghiệm kiểm tra các virút ngoại lai trên tế bào
Mẫu thử: Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh.
Tiến hành: – Xem phần 2.1.2.3
Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu – Xem phần 2.1.2.4
2.1.4.1. Thử nghiệm kiểm tra các virút ngoại lai trên động vật thí nghiệm
Dụng cụ và trang thiết bị
- Bơm kim tiêm 1ml, 3ml, 5ml (Vinahankook) - Găng tay, bông vô trùng, cồn 70° (Việt Nam)
Vật liệu và hóa chất
- Chuột ổ dưới 24 giờ tuổi: 20 con
- Chuột Swiss trưởng thành 15-20 gam: 20 con - Chuột lang trưởng thành 350-450 gam: 5 con
- Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh
Tiến hành
Thử nghiệm trên chuột ổ dưới 24 giờ tuổi
* Mẫu thử: Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh
- Đường tiêm não: liều tiêm 0,01ml/con; 10 con - Đường tiêm ổ bụng: liều tiêm 0,1ml/con; 10 con
*Mẫu chứng: Không tiêm.
*Theo dõi sau tiêm: Theo dõi chuột hàng ngày trong 14 ngày sau tiêm.
Thử nghiệm trên chuột Swiss trưởng thành
* Mẫu thử: Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh
- Đường tiêm não: liều tiêm 0,03ml/con; 10 con - Đường tiêm ổ bụng: liều tiêm 0,5ml/con; 10 con
*Mẫu chứng: Không tiêm.
*Theo dõi sau tiêm: Theo dõi chuột hàng ngày trong 21 ngày sau tiêm.
Thử nghiệm trên chuột lang
* Mẫu thử: Hỗn dịch trung hòa chủng virut và kháng huyết thanh
- Đường tiêm ổ bụng: liều tiêm 5 ml/con; 5 con
*Mẫu chứng: Không tiêm. *Theo dõi sau tiêm
- Theo dõi chuột hàng ngày trong 42 ngày sau tiêm. - Theo dõi nhiệt độ chuột 21 ngày đầu sau tiêm.
Kết quả
Tiêu chuẩn chấp thuận
- Thử nghiệm đạt yêu cầu khi có ít nhất 80% chuột sống sót trong quá trình theo dõi.
+ Có ít nhất 80% chuột sống sót trong quá trình theo dõi.
+ Sau khi kết thúc quá trình theo dõi, mổ giải phẫu: các cơ quan ngũ tạng không có dấu hiệu bất thường.
2.1.4.2.Thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá virút TCID50
Dụng cụ và trang thiết bị
- Tủ ấm CO2 (Sanyo) - Pipet 10ml, 25ml vô trùng (Corning)
- Kính hiển vi đảo pha (Olympus) - Đầu típ 200µl, 1000µl (Corning)
- Máy trộn (Stuard) - Tuýp nhựa 1,5ml (Eppendorf)
- Pipet Aid (Thermo) - Phiến nuôi cấy tế bào 96 giếng (Nunc)
- Pipetman (Gilson) - Pipet đa kênh (Thermo)
Vật liệu và hóa chất
- Tế bào vero - Trypsin (Gibco)
- Môi trường MEM (Gibco) - Huyết thanh bê bào thai (Gibco) - Mẫu thử: Chủng giống EV71; hỗn dịch EV71
Tiến hành