Thửnghiệm kiểm tra tính ổn định di truyền a Quy trình tách chiết ARN của virut

- Mẫu thử pha loãng bậc 10 (từ 102 đến

2.1.4.3. Thửnghiệm kiểm tra tính ổn định di truyền a Quy trình tách chiết ARN của virut

a. Quy trình tách chiết ARN của virut

Dụng cụ và trang thiết bị

- Máy ly tâm (Eppendorf) - Pipetman (Gilson)

- Máy trộn (Stuard) - Đầu típ 20µl; 200µl; 1000µl (Corning)

Vật liệu và hóa chất

- Mẫu thử: Chủng giống EV71, hỗn dịch EV71 - Bộ Sinh phẩm QIAamp Viral RNA (Qiagen)

Tiến hành

- Chuẩn bị dung dịch ly giải AVL có chứa chất mang ARN

- Cho 140l mẫu vào tuýp có chứa 560l dung dịch ly giải AVL có chứa chất mang ARN, trộn bằng máy trộn khoảng 15 giây để tạo hỗn dịch đồng nhất. Ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút, đảm bảo các hạt virut bị ly giải hoàn toàn, khi virut bị ly giải ARN được gắn vào chất mang ARN, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 3 giây để dung dịch dính trên nắp và thành tuýp lắng xuống.

- Cho 560l cồn tuyệt đối vào tuýp trên, trộn đều bằng máy trộn trong vòng 15 giây, cồn sẽ tủa các sợi ARN. Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 3 giây để dung dịch dính trên nắp và thành tuýp lắng xuống.

- Chuẩn bị cột QIA amp spin đặt vào tuýp 2ml. Cho 630 l (một nửa số mẫu trên) vào cột QIA amp spin, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Tất cả ARN

sẽ được gắn trên bề mặt màng Silicagel với sự có mặt của chất mang ARN, loại bỏ phần dịch lọc trong tuýp 2 ml, đặt cột QIA amp spin đặt vào tuýp 2ml.

- Cho nốt phần mẫu còn lại 630 l vào cột QIA amp spin trên, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút, loại bỏ phần dịch lọc trong tuýp 2 ml, đặt cột QIA amp spin đặt vào tuýp 2ml.

- Cho 500 l dung dịch rửa AW 1 có chứa ethanol 100% vào cột QIA amp spin ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút để loại bỏ các thành phần không phải là ARN có mặt trên màng Silicagel. Loại bỏ phần dịch lọc trong tuýp 2 ml, đặt cột QIA amp spin đặt vào tuýp 2ml.

- Cho 500 l dung dịch rửa AW 2 có chứa ethanol 100% vào cột QIA amp spin ly tâm 14000 vòng/ phút trong 3 phút để loại bỏ các thành phần không phải là ARN có mặt trên màng Silicagel. Loại bỏ tuýp 2 ml có chứa dịch lọc, đặt cột QIA amp spin đặt vào tuýp 2ml mới.

- Ly tâm 14000 vòng/ phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa.

- Chuyển cột QIA amp spin vào tuýp 1,5 ml sạch. Mở nhẹ nhàng nắp cột QIA amp spin, cho 60 l dung dịch AVE. Đậy nắp ủ tại nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Tất cả ARN có trong mẫu sẽ tách khỏi màng Silicagel bằng dung dịch AVE không có Rnase, có chứa 0.04% sodium azide. Khi ly tâm toàn bộ ARN của mẫu sẽ được thu hồi trong dung dịch.

ARN sau tách triết được bảo quản tại - 20C hoặc - 70C trong một năm.