- Mẫu thử pha loãng bậc 10 (từ 102 đến
b. Quy trình thực hiện kỹ thuật RT-PCR trực tiếp: Xem phần 2.1.4
Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR/HCV (Vòng 1): (45°C/ 30 phút; 94°C/2 phút) x 1 chu kỳ; (94°C/40 giây; 45°C/45 giây; 72°C/30 giây) x 30 chu kỳ; 72°C/7 phút ; 10°C/ kết thúc.
Bảng 2.7. Công thức cho một phản ứng PCR/HCV (Vòng 2)
Nguyên liệu Thể tich (l)/ tuýp
PCR Master Mix (2X) 25 Mồi xuôi 2 5 Mồi ngược 2 5 DW 12 ADN (Sản phẩm vòng 1) 3 Tổng 50
Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR/HCV (Vòng 2): 94°C/2 phút 30 giây; (94°C/40 giây; 45°C/45 giây; 72°C/1 phút 30 giây) x 45 chu kỳ; 72°C/10 phút ; 10°C/ kết thúc.
c. Quy trình kiểm tra sản phẩm PCR: Xem phần 2.1.4.3 c
Dụng cụ và trang thiết bị
- Máy ly tâm (Eppendorf) - Tủ ấm (Memmert)
- Kính hiển vi đảo pha (Olympus) - Kính hiển vi điện tử 1010 (JEOL)
Vật liệu và hóa chất
- Chủng EV71 - Glutaraldehyte 1%
- Giấy parafilm (Fisher) - Bacitracin 0.01%; BSA 0.2%; PBS
- Mab-VP1/EV71 (Millipore) - Uranyl acetate 1%
- PrA-Au (hạt vàng 10nm) (Sigma) - Amonium acetate 1% - Lưới đồng phủ màng collodion-cacbon (EMS)
Tiến hành
Phương pháp nhuộm âm bản
Phương pháp này được thực hiện trên giấy parafilm theo kiểu nhỏ giọt sử dụng lưới đồng có phủ màngcollodion-cacbon
-Bacitracin 0.01%/ nước cất -Đưa mẫu lên lưới
-Cố định
Phương pháp miễn dịch hiển vi điện tử gắn vàng nhuộm âm bản
- Đưa mẫu virut lên lưới, gắn kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu VP1/EV71. Gắn PrA-Au
-Rửa mẫu, cố định mẫu, nhuộm, để khô.
Đọc kết quả:
-Quan sát virút dưới kính hiển vi điện tử LEOL 1010
2.2. Quy trình sản xuất và kiểm tra chất lượng văcxin EV71 trên tế bào vero vero
2.2.1. Quy trình sản xuất vắcxin EV71 trên tế bào Vero 2.2.1.1. Gây nhiễm và nuôi cấy virut 2.2.1.1. Gây nhiễm và nuôi cấy virut
Dụng cụ và trang thiết bị
- Tủ ấm (Memmert) - Chai thủy tinh 200ml, 500ml (Schott)
- Tủ cấy vô trùng (Microflow) - Pipet 5ml, 10ml,25ml,50ml (Corning) - Kính hiển vi đảo pha (Olympus) - Tuýp nhựa 1,5ml (Eppendorf)
- Pipet Aid (Thermo) - Đầu típ 200μl; 1000μl (Corning)
- Pipetman (Gilson)
Vật liệu và hóa chất
- Chủng virut gốc sản xuất: WS - EV71/0822/C6 - 0112 - Tế bào Vero kín 1 lớp nuôi cấy trên chai 150 cm2 - Môi trường nuôi cấy tế bào: MEM
- Dung dịch muối Hank’s - Tế bào chứng
Tiến hành