- Thử nghiệm vô khuẩn
2.1.2. Kiểm tra chất lượng tế bào vero 1.Thử nghiệm vô khuẩn
Dụng cụ và thiết bị
- Tủ cấy vô trùng (Microflow) - Pipet Aid (Thermo)
- Tủ ấm (Memmert) - Pipet 2ml (Corning)
- Nước nổi nuôi cấy tế bào; chủng giống EV71; bán thành phẩm; bán thành phẩm cuối cùng; vắcxin thành phẩm.
Môi trường:
Loại môi trường
+ Môi trường Thioglycolate (Vabiotech)
+ Môi trường Soybean (Soybean Casein Digest) (Vabiotech) + Thể tích môi trường: 20ml/ống
Số lượng môi trường
* Nước nổi nuôi cấy tế bào; bán thành phẩm; bán thành phẩm cuối cùng. - Môi trường Thioglycolate: 05 ống/1 loạt mẫu thử.
- Môi trường Soybean: 05 ống/1 loạt mẫu thử. * Vắcxin thành phẩm.
- Môi trường Thioglycolate: 30 ống/1 loạt mẫu thử. - Môi trường Soybean: 10 ống/1 loạt mẫu thử.
Tiến hành
Phương pháp: cấy trực tiếp.
Thể tích cấy: 1ml mẫu thử/1 ống môi trường.
Các bước tiến hành
- Dùng Pipét 2ml để lấy mẫu thử từ trong mỗi chai (hoặc lọ), cấy trực tiếp vào môi trường bằng cách đưa sâu đầu pipet tới đáy ống. Phối hợp động tác bơm mẫu thử và di chuyển pipet từ đáy ống môi trường lên trên mặt ống môi trường theo một đường thẳng.
- Sau khi cấy khử trùng miệng ống môi trường cẩn thận trên đèn cồn và đậy kín bằng nút bông vô trùng. Các thao tác lặp lại như vậy cho đến hết số chai mẫu thử cần thử.
Sau khi các thao tác trong phòng vô trùng được tiến hành xong, các ống môi trường sẽ được xếp vào 2 giá và giữ ở hai nhiệt độ khác nhau:
- Môi trường Thioglycolate: 30-350C - Môi trường Soybean: 20-250C
Thời gian nuôi cấy: 14 ngày.
Theo dõi sau thử nghiệm
- Cả hai loại môi trường được theo dõi hàng ngày và ghi kết quả theo dõi vào phiếu theo dõi thử nghiệm vô khuẩn vào các ngày 1, 3, 5, 7, 10 và 14.
Kết quả
Cách đọc kết quả
- Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm: cả 2 loại môi trường đều trong, không bị vẩn đục. Lớp chỉ thị màu phía trên ống môi trường Thioglycolate không bị mất màu (-)
- Có sự phát triển của vi khuẩn và nấm: 1 hoặc cả 2 loại môi trường bị vẩn đục. Lớp chỉ thị màu phía trên ống môi trường Thioglycolate bị mất màu (+)
Giá trị của thử nghiệm
- Loạt môi trường sử dụng để kiểm tra vô khuẩn đạt yêu cầu về thử nghiệm kiểm tra chất lượng môi trường khi kiểm tra bằng thử nghiệm “tăng sinh”.
Tiêu chuẩn chấp thuận
- Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi.
Thử nghiệm nhắc lại
- Điều kiện nhắc lại
- Khi không đạt tiêu chuẩn: Một ống môi trường trong số 5 cặp ống môi trường sử dụng cho 1 mẫu cho kết quả (+).
- Nếu có ống môi trường nuôi cấy bị nhiễm khuẩn phải tiến hành phân lập và định danh vi sinh vật.
- Thử nghiệm nhắc lại lần 1
- Thực hiện với số lượng mẫu và ống môi trường bằng lần thử đầu. - Thử nghiệm đạt khi tất cả các ống môi trường nuôi cấy cho kết quả (-) - Nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong bất kỳ ống môi trường nuôi cấy nào phải phân lập và định danh vi sinh vật.
- So sánh kết quả với lần thử đầu: Nếu không có sự khác biệt, sản phẩm được coi là không đạt vô khuẩn và phải hủy bỏ. Nếu có sự khác biệt, phải tiến hành thử nghiệm nhắc lại lần 2.
-Thử nghiệm nhắc lại lần 2
- Thực hiện với số lượng mẫu và ống môi trường gấp đôi lần thử đầu. - Thử nghiệm đạt khi tất cả các ống môi trường nuôi cấy cho kết quả (-) - Nếu phát hiện dù chỉ 1 ống môi trường nuôi cấy có sự phát triển của vi sinh vật, loại sản phẩm đó được kết luận là không đạt yêu cầu về tiêu chuẩn vô khuẩn, phải hủy bỏ.