Thu thập In vitro
Để bảo tồn In vitro từ khâu thu thập thực hiện các kỹ thuật phù hợp đã được trình bày chi tiết trong chương thu thập nguồn gen (phương pháp thu thập In vitro). Sau khi thu thập tiến hành chuyển mẫu thu thập sang môi trường nuôi cấy In vitro đã có thêm chất chậm sinh trưởng. Nhiều nghiên cứu cho kết quả môi trường MS- sắt 138 có tác dụng chậm sinh trưởng với nhiều loài cây trồng như củ mỡ, cà phê.
Vật liệu bảo tồn In vitro
Bảo tồn In vitro gồm bảo tồn callus, chồi, mầm và cây con tạo ra từ các mắt hoặc đỉnh sinh trưởng dưới điều kiện của các tố môi trường, buồng nuôi cấy và giá thể (môi trường nuôi cấy), trong điều kiện vô trùng và không ảnh hưởng đến sức sống nguồn gen. Phương pháp nuôi cấy In vitro thực hiện theo tiêu chuẩn kỹ thuật và môi trường tiêu chuẩn với mỗi loài cây trồng.
Xử lý sạch bệnh
Giai đoạn thu thập và các giai đoạn kỹ thuật khác của phương pháp bảo tồn In vitro, lựa chọn vật liệu, khử trùng bệnh virus là kỹ thuật quan trọng đảm bảo bảo tồn thành công. Ví dụ sơ đồ làm sạch bệnh khoai tây trong bảo tồn In vitro của CIP minh họa trong hình 4-15.
Hình 4-15: Các bước làm sạch virus trong bảo tồn nguồn gen khoai tây In vitro
Chất làm chậm sinh trưởng
Sinh trưởng chậm là kỹ thuật cho phép vật liệu vô tính thực vật sinh trưởng hay phát triển chậm, những chất này có thể hỗ trợ bảo tồn 1 - 15 năm dưới điều kiện nuôi cấy mô hoặc nuôi cấy định kỳ, tùy theo loài cây trồng. Một số kỹ thuật làm chậm sinh trưởng khác nhau để duy trì bảo tồn, nhưng hầu hết các kỹ thuật là nhiệt độ thấp kết hợp với cường độ ánh sáng yếu hoặc tối để hạn chế sinh trưởng. Nhiệt độ trong phạm vi từ 0 - 5oC với các loài nguồn gen chịu lạnh, các loài cây nhiệt đới nhiệt độ 15 - 20oC.
Cũng có thể làm chậm sinh trưởng bằng cải tiến môi trường nuôi cấy, chủ yếu là giảm hàm lượng đường và các nguyên tố vi lượng và ô xy trong phòng bảo tồn, hoặc phủ lên khối mô dung dịch hoặc dầu vi lượng (Withers và Engelmann,1997). Yếu tố vi lượng có tác dụng chậm sinh trưởng được nhiều nghiên cứu công bố là sắt 138 với nồng độ 100 - 200 mg/lít có hiệu quả nhất. Ví dụ nghiên cứu bảo tồn nguồn gen củ mỡ bằng môi trường dinh dưỡng vi lượng và đường sucrose thấp hầu hết các mẫu nguồn gen có thể duy trì được 2 năm
Sử dụng các chất gây bất thuận đưa vào môi trường nuôi cấy làm chậm sinh trưởng như manitol, sorbitol, đường sucrose, những chất này hạn chế sinh trưởng rất hiệu quả. Một số chất điều tiết sinh trưởng cũng có khả năng làm chậm sinh trưởng như ABA , Phosphon-D, succinic a xít. Làm chậm sinh trưởng trong bảo tồn In vitro có thể sử dụng từng kỹ thuật riêng rẽ hoặc kết hợp của tất cả các kỹ thuật trên
Phương pháp làm chậm sinh trưởng ứng dụng rộng với nhiều loài, nhưng sử dụng để bảo tồn nguồn gen mới chỉ ở một số loài như chuối, khoai tây, khoai lang, sắn, củ mỡ và một số loài cây nhiệt đới. Theo FAO, 1996 có khoảng 37.600 mẫu nguồn gen đang được bảo tồn In vitro trên toàn cầu.
- Đánh giá và kiểm tra trong quá trình bảo tồn
Đánh giá vệ sinh và mức độ vô trùng của buồng bảo tồn, mức độ ổn định và biến dị di truyền của vật liệu bảo tồn được thực hiện định kỳ, bởi vì nuôi cấy In vitro có thể xuất hiện biến dị xô ma. Những đặc điểm khác như mức độ sinh trưởng chậm, hình thành callus, chiều dài thân, sự xuất hiện rễ và tình trạng bệnh nguồn gen bảo tồn cũng được đánh giá. Định kỳ đánh giá theo tháng hoặc năm. Thời gian bảo tồn In vitro phụ thuộc vào loài và vật liệu bảo tồn thực hiện thay đổi môi trường 1 - 2 năm thay một lần