a) Thu thập nguồn gen cây chuối
Luz M. Montoya Hennao và cộng sự đã thực hiện và có kết quả thu thập In vitro với chuối. Chuối là một nguồn tài nguyên di truyền thực vật đang có nguy cơ xói mòn. Jaramillo,1983 chỉ ra rằng nguồn gen các giống và dạng hoang dại (Musa AA, BB, ABB, AAA và AAAB...) ngày càng ít và biến mất khỏi trung tâm đa dạng di truyền của loài cây này. Do vậy IPGRI đa có chương trình ưu tiên thu thập bảo tồn Ex situ bắt đầu từ năm 1983. Cây chuối là cây nhân giống vô tính bởi vì quả của nó không hạt (parthenocarpic) khi thu thập truyền thống là thu chồi mầm rất khó khăn và chi phí lớn . Phương pháp thu thập In vitro phu hợp hơn
Thu thập mầm cao 30 - 50 cm, loại bỏ các phần không cần thiết và các bẹ lá để được mầm dài 8 cm và đường kính 5 cm, khử trùng bề mặt mầm bằng chlorine 5,25% (sodium hypochlorite) trong 20 phút, rửa bằng nước tiệt trùng 5 phút, trong một số trường hợp có thể rửa bằng xà phòng hoặc nước rửa, tiếp theo ngâm trong dung dịch chống oxy hóa (ascobic acid 100mg/L) trong 10 phút. Sau đó giảm kích thước vật liệu bằng kìm và dao mổ đến 4 - 5
cm để nuôi cấy In vitro. Khử trùng mô bằng cồn 70% và đưa mô vào môi trường MS ( Murashige và Skoog, 1962).
Bảng 2-7: Môi trường cho thu thập In vitro nguồn gen cây chuối AAA của cv Valery tại
CATIE, Costa Rica
Môi trường Thành phần
1( đ/c) MS, vitamin, sucrose, agar
2 MS, than hoạt tính, vitamin, sucrose, agar 3 MS, than hoạt tính, vitamin, sucrose, agar
benomyl, gentamycin
4 MS, vitamin, ampicillin, sucrose, agelrite 5 MS, vitamin, chloramphenicol, sucrose,
agelrite
Nguồn: Valerie C. Pence và cộng sự 2002
Môi trường bổ sung thêm vitamin, than hoạt tính (activated charcoal) 0,15%, thuốc trừ nấm và vi khuẩn phổ rộng (benomyl 100mg/L, gentamycin, 100mg/L ampicillin 100mg/L; chloramphenicol 100mg/L) nhưng nồng độ thấp tránh độc cho mô. Môi trường cũng có thêm đường sucrose 30g/L, Difco agar 7 g/L hoặc Gelrite 2 g/L
Cắt để giảm kích thước, trong điều kiện buồng di động nhưng đảm bảo khuất gió và phun ethanol và cồn 70% để khử trùng. Sau khi công việc thực địa hoàn tất, mô nuôi cấy đưa vào hộp, hộp đã phun cồn 70% khử trùng, chuyển đến phòng thí nghiệm di động nhiệt độ 26±1oC, độ ẩm 80%, ánh sáng 16 giờ chiếu sáng và 8 giờ tối, cường độ ánh sáng 50µE m-2 s-1. Vệ sinh và kiểm tra khử trùng buồng nuôi cấy, dụng cụ, mô có thể sống 5 - 7 ngày sau khi cấy. Đánh giá mức độ hóa nâu của mô nuôi cấy theo thang điểm 0 - 3 như sau:
0 - không nâu
1-thỉnh thoảng có vết nâu 2-Hóa nâu trung gian 3- hóa nâu
Kết quả là sau 5 ngày nuôi cấy chỉ có môi trường 3 nhiễm nấm 20%, 7 ngày sau nuôi cấy môi trường 2 cũng nhiễm 20% vi khuẩn chỉ ra rằng nếu thời gian thu thập kéo dài hơn tỷ lệ nhiễm ngày càng cao. Có sự khác nhau về hóa nâu khi cắt bằng kìm và kéo, hóa nâu lớn hơn chỉ bằng kéo hay bằng tay. Các mẫu sống 100% và phụ thuộc vào kỹ thuật khử trùng bề mặt mô, không có sự sai khác có ý nghĩa với các môi trường khác nhau
b) Thu thập nguồn gen họ cam quýt (Abdenago Brenes Hines và cộng sự,2002)
Hạt là nguồn vật liệu chính, đơn giản và kinh tế nhất trong thu thập và bảo tồn nguồn gen cây trồng, trong trường hợp những loài cây nhân giống vô tính, hạt cứng có thể sử dụng kỹ thuật khác thay thế như In vitro (withers,1987). Họ cam quýt Citrus L. nhân giống vô tính sinh dưỡng bằng ghép, chiết hoặc giâm cành là phổ biến để giữ nguyên được kiểu gen, ngay cả trong trường hợp có hạt bình thường. Nhưng khả năng nảy mầm của hạt cam quýt bị suy giảm nhanh nếu độ ẩm giảm xuống dưới 70% và như vậy trong điều kiện nhiệt đới hạt mất sức nảy mầm nhanh và dẫn đến ngủ nghỉ. Phương pháp thay thế thu thập hạt là thu thập In vitro với các vi mô và hạt như một phương tiện thu thập, bảo tồn giá trị nguồn gen họ cam quýt.
Navarro(1984) nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô truyền thống với chi Citrus đã nêu ra kỹ thuật quan trọng được ứng dụng như sau:
-Nuôi cấy bầu nhụy để nhận được các cây phôi tâm từ quả không hạt đa phôi
-Vi ghép để thu được cây sạch bệnh
Không sử dụng lạnh trong quá trình này, thu thập trong thời kỳ ngủ nghỉ như mùa đông ở khu vực Á Nhiệt đới, mô non là nguồn tốt nhất cho vi ghép (Skirvin,1981; Marte,1987). Mặc dù vậy, nguyên lý chính của thu thập In vitro là trong điều kiện vô trùng, do vậy thời gian từ thực địa đến khi đưa vào phòng thí nghiệm cần ngắn nhất. Trường hợp thu thập trong thí nghiệm này là Citrus sinesis L. Các cành non, thẳng khoảng 8 cm lấy từ phần non của cây cắt ra khỏi cây, sau đó cắt thành đoạn nhỏ (vi mô) từ 3 - 4 cm, trong trường hợp thu mẫu là cơ quan sinh dưỡng, thu mẫu hạt cũng thu những hạt từ những quả chín, khỏe mạnh và loại bỏ vỏ hạt trước khi khử trùng bề mặt để nuôi cấy In vitro.
Khử trùng bề mặt vi mô sinh dưỡng bằng ngâm nước rửa sodium hypochlorite từ 3 - 5% trong 3 phút, sau đó rửa nhẹ 2 lần bằng nước đã tiệt trùng (01 phút một lần). Đối với thu hạt khử trùng bề mặt quả bằng lửa đèn cồn, sau đó lấy hạt và loại bỏ vỏ hạt, hạt được ngâm 3 phút trong nước tiệt trùng hoặc trong dung dịch sodium hypochlorite 3% trong 3 phút, sau đó rửa nhẹ 2 lần bằng nước sạch (mỗi lần 1 phút), tiếp theo cấy vào môi trường đã chuẩn bị trước.
Môi trường sử dụng cho cả hạt và vi mô sinh dưỡng Môi trường MS
-MS+ampicillin (100mg/L) + benomyl ( 50mg/L) (Môi trường MS-AB)
-MS+ chloramphenicol (2,5mg/L) + benomyl ( 50mg/L) (Môi trường MS-CB)
-Môi trường được hấp trong nồi hấp ở 121oC và 15 p.s.i trong 20 phút, bổ sung chất kháng sinh vào môi trường sau khi hấp. Khử trùng để hạn chế nguồn lây nhiễm như làm sạch bề mặt bề mặt dụng cụ, nơi làm việc (khay kim loại 53 x 30 cm) và kẹp, ghim với ethanol 70% sau đó hơ trên lửa đèn cồn. Sau khi nuôi cấy, mô được đưa vào thí nghiệm có điều khiển môi trường ( 27±2oC, cường độ ánh sáng 2.500 lux, độ dài chiếu sáng 16 giờ và 8 giờ tối/ngày.
-Sau 2 - 4 ngày đánh giá mô sau nuôi cấy trên hiện trường
-Phần trăm mô nhiễm bệnh
-Phần trăm mô phục hồi trở lại
-Phần trăm vi mô sinh dưỡng chuyển màu nâu
-Tỷ lệ phục hồi một nửa tạm thời
Tình trạng phục hồi của mẫu được xác định bằng một trong những đặc điểm sau:
-Khỏe mạnh, không nhiễm bệnh, không bị hoại sinh
-Nhiễm từng phần, nhưng số còn lại đủ để khử trùng tạo thành mẫu mới cho vào môi trường In vitro nuôi cấy
-Một số phần hoại sinh, nhưng vần đủ làm nguồn vật liệu khử trùng và nuôi cấy Kết quả cho thấy trên 87,7% vi mô sinh dưỡng phục hồi sau 2 - 4 ngày nuôi cấy, sau 2 ngày tỷ lệ nhiễm thấp chỉ 3,3% nhiễm khuẩn, sau 4 ngày tỷ lệ nhiễm tăng lên 13,3% nấm bệnh, hai môi trường MS-AB và MS-BC không khác biệt và đều đạt 100% phục hồi có khả năng nuôi cấy được. Đối với hạt khô bóc vỏ giảm nhiễm nấm bệnh (trung bình 16,7%), không nhiễm khuẩn, hạt biểu hiện nảy mầm cao (83,3%). Môi trường MS-CB phù hợp cho thu thập hạt bằng phương pháp thu thập In vitro.
Bảng 2-8: So sánh các phương pháp sử lý bề mặt và môi trường khi thu thập In vitro với vi
mô sinh dưỡng của cây họ cam quýt
Tỷ lệ nhiễm sau 2
ngày(%) Tỷ lệngày(%) nhiễm sau 4
Xử lý Số mẫu phục hồi trung bình sau 2 ngày(%) Số mẫu phục hồi trung bình sau 4
ngày(%) Nấm Vi khuẩn Nấm Vi khuẩn Tất cả xử lý 87,7 0 3,3 87,7 13,3 3,3 Khử trung bề mặt 3% NaClO 80 0 0 80 6,7 0 5% NaClO 93,3 0 6,7 93,3 20 6,7 Môi trường MS 80 0 10 80 20 10 MS-AB 80 0 0 80 10 0 MS-CB 100 0 0 100 10 0
Nguồn : Abdenago Brenes Hines và cộng sự,2002 c) Thu thập cây khoai sọ ( Mary Taylor,2002)
Cây khoai sọ (Colocasia esculenta L. var esculenta) là một cây trồng lấy củ quan trọng là cây rau và cũng là cây lương thực của nhiều nước. Nhu cầu cần thu thập bảo tồn khi bệnh bạc lá do nấm Phyophthora colocasiae lan rộng đến Hoa Kỳ những năm 1993. Sử dụng In vitro thu thập nguồn gen cây khoai sọ được giới thiệu đầu tiên vào giữa những năm 1980 với sự hỗ trợ của dự án cây có củ của UNDP/FAO. Thu thập và duy trì nguồn gen cây khoai sọ bằng nuôi cấy mô do South Pacific Commision (SPC), sau đó quỹ EU hỗ trợ và thực hiện nuôi cấy mô trong phòng thí nghiệm tại đại học Nam Thái Bình Dương, Samoa. Những năm gần đây dự án thu thập nguồn gen khoai sọ bằng phương pháp In vitro được hỗ trợ của AusAID. Nuôi cấy mô trực tiếp từ cây trên đồng ruộng, các bước sử dụng các phòng thí nghiệm di động như đã trình bày. Gồm dụng cụ chứa có gắn nhãn có môi trường đã khử trùng, dụng cụ khử trùng, kẹp, ghim, kéo. Một hộp nhỏ chứa tác nhân ướt, đĩa petri, giấy tiệt trùng, để cắt mẫu, dao nhỏ, bình plastic nhỏ đã khử trùng đựng các dụng cụ và cồn để khử trùng
Dùng dao cắt chồi rễ và các lá cây mẹ sau đó dùng dao sắc cắt tỉa chồi, rễ nhỏ hơn đến khi còn khoảng 4 cm là mô thu thập, thân hành cơ bản xấp xỉ 1 cm2, không cần rửa sạch bằng nước, đất được lau sạch trong quá trình cắt tỉa bằng khăn
Từ giai đoạn này tất cả được làm bằng tay bên trong hộp cát tông với phía trước mở và hộp đã được tẩy trắng trước khi sử dụng. Ngâm mô thu thập trong dung dịch NaClO 2% cộng thêm chất giữ ẩm trong 15 phút. Trong quá trình tẩy trùng bình chứa phải lắc liên tục. Sau khi khử trùng bóc bớt những mô bên ngoài bằng dụng cụ đã khử trùng, nếu có thể thì khử trùng dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn
Mô sau khi đã khử trùng được cấy lên môi trường MS và hàn kín, lần nuôi cấy này được giữ đến khi đưa về phòng thí nghiệm để bảo tồn, đặt chúng trong phòng sinh trưởng 2 - 4 tuần và luôn luôn kiểm tra tình hình nhiễm bệnh. Sau giai đoạn này mô được tiếp tục cắt nhỏ đến khoảng chiều dài 01 cm với kích thước củ 0,2cm2 và chuyển đến môi trường sạch