a) Nguyên lý lấy mẫu trong thu thập nguồn gen
Chiến lược lấy mẫu phụ thuộc vào loài cây trồng là cây tự thụ phấn, giao phấn hay sinh sản vô tính và khả năng trao đổi gen giữa các quần thể, cũng như mục đích thu thập đa dạng di truyền tại khu vực. Mặc dù vậy, lý thuyết lấy mẫu phụ thuộc chủ yếu vào những hiểu biết về phương thức biến dị, di truyền của quần thể. Nhìn chung có một số ít loài đã có những thông tin về biến dị di truyền của loài. Hầu hết các loài biểu hiện biến dị trên các điều kiện địa lý rất rộng và có them những biến dị trong nội bộ quần thể. Môi trường sinh thái hoặc các yếu tố quyết định đến đa dạng di truyền và kiểu sinh thái được nhận biết rõ nhất ở các giống bản địa và giống địa phương. Các yếu tố khí hậu như nhiệt độ trung bình, tối đa, tối thiểu, lượng mưa, mùa nghủ nghỉ, sinh trưởng, cường độ ánh sáng, độ dài chiếu sáng sẽ phản ánh đầy đủ qua phản ứng các đặc điểm sinh trưởng và phát triển của thực vật (Bennett, 1970). Các yếu tố như vậy dẫn đến các dạng biến dị, trong khi địa hình và thổ nhưỡng quyết định những dị đặc biệt hay thể khảm. Do đó cần xem xét đến các yếu tố trên trong lấy mẫu và tần suất mẫu. Rõ ràng rằng kiểu biến dị địa lý cũng sẽ bao gồm các đặc điểm chống chịu bệnh, đặc điểm hình thái và các đặc điểm đáng chú ý khác cũng như các biến dị số lượng phù hợp cho chọn tạo giống cây trồng. Mặc dù giống và dòng dõi có thể giống nhau về hình thái nhưng chúng khác nhau rất lớn về những đặc tính đặc biệt là đặc tính sinh lý. Biến động trong một quần thể, đặc biệt là ở một địa phương phụ thuộc vào hệ thống tạo giống
của các loài, phương thức duy trì quần thể dị hợp ở các loài giao phấn và phương thức duy trì cấu trúc di truyền ở các loài tự thụ phấn. Ngày nay các nhà khoa học đã chúng minh rằng các quần thể như thế chứa nhiều biến dị di truyền và dị hợp. Phương pháp lấy mẫu phải đảm bảo thu thập đại diện các biến dị trong quần thể cũng như những biến dị theo địa lý, sinh thái khác nhau
Các nguyên lý chọn điểm và số lượng mẫu liên quan đến đa dạng di truyền đã được Marshall và Brown (1975), Hawkes (1980), Chang (1985) nêu ra và thảo luận, nhưng sử dụng phương pháp tùy thuộc rất lớn vào cách tiếp cận. Lấy mẫu tự nhiên và ngẫu nhiên theo khoảng thời gian xác định trước là thỏa mãn cho sự chính xác của lấy mẫu. Khoảng thời gian có thể rộng nếu điều kiện sinh thái và thổ nhưỡng, môi trường đồng nhất. Lấy mẫu theo những điểm nhỏ, cân đối trong một vùng nếu vùng đó có thay đổi nhanh theo độ cao và địa hình, loại đất, kỹ thuật canh tác hay môi trường sinh thái, mức độ thay đổi có thể quan sát nhận biết được một cách rõ ràng.
Lấy mẫu ở điều kiện tự nhiên đặc thù hay lặp lại với các loài hoang dại của hệ thống gen, lấy mẫu nên ở nhiều điểm riêng biệt trong cùng một khu vực. Nhận biết các dạng đặc thù như các giống chống chịu hạn, chống chịu bệnh. Đối với họ hàng hoang dại hay các nhóm cây cỏ, thu thập từ các quần thể xung quanh hoặc bên trong ruộng canh tác. Theo Chang,1985 cũng nên thu thập chúng ở nhưng nơi thích hợp như nơi giao thoa thổ nhưỡng- sinh thái và môi trường sống tự nhiên
Phương pháp lấy mẫu hỗn hợp tại một điểm bằng thu hoạch ngẫu nhiên các bông, quả cùng một số lượng trên một cây nhưng ở vài điểm trên cây đó.
Đường đi lấy mẫu trên ruộng: cán bộ thu thập đi ngang qua điểm hoặc ruộng 2 lần theo hình chéo hoặc zigzag và tránh lấy mẫu quanh đường biên.
Phương pháp lấy mẫu theo kẻ ô sẽ có đại diện tối đa của một quần thể nếu điểm lớn và có điều kiện thổ nhưỡng - sinh thái khác biệt
Phương pháp kiểu lấy mẫu đám (clustered sampling pattern): thu thập một vài mẫu trong một khu vực nhỏ và trên một khu vực rộng cần thu thập ở một số điểm diện tích nhỏ như vậy. Lấy mẫu đám cho phép thu được biến dị lớn của cả môi trường địa lý và vị trí địa lý khác nhau. Phương pháp này rất phù hợp cho thu thập mẫu nguồn gen cây hoang dại.
Những khu vực có vấn đề về sức khỏe nguồn gen, nên thu thập những cây khỏe mạnh. Những nơi sâu bệnh hại, điều kiện bất thuận nhưng thường lại có nhưng kiểu gen quý
b) Tần suất và cỡ mẫu thu thập nguồn gen
Tần suất lấy mẫu (số mẫu trên một điểm) và cỡ mẫu sẽ khống chế bằng mức đa dạng di truyền và dòng gen trong một nhóm (vật liệu cây trồng hoặc hoang dại) và sinh thái nông nghiệp của điểm thu thập. Cán bộ thu thập nên sử dụng phương pháp tiếp cận thực tế, quan sát tại chỗ để đưa ra kỹ thuật lấy mẫu phù hợp nhất.
Cỡ mẫu cũng như số mẫu tối ưu trên một điểm đảm bảo chứa 95% tất cả các allel tại locus ngẫu nhiên trong quần thể mục tiêu với mức tin cậy lớn hơn 0.05 (Hawkes, 1976; Marshall và Brown, 1975).
Hawkes (1980) chỉ ra rằng khoảng 50 hạt trên một bông hoặc bắp để đảm bảo có tổng số 2.500 đến 5.000 hạt với mẫu là phổ biến ở cây trồng có biến động cao. Với loài có bông, và gié như kê 2.000 đến 4.000 hoặc hơn, mỗi phần của bông yêu cầu lấy số lượng là 50 hạt.
Lấy mẫu ngô trên ruộng cứ 10 - 20 bước chân thu một bắp, và chia theo mặt cắt ngang cứ 5 -10 hàng lấy mẫu trên một hàng.
Lấy mẫu với cây có quả mọng như như cà chua, ớt, dưa chuột cơ bản cũng tương tự như ngô, mỗi quả chứa 50 hạt và khoảng 50 - 100 quả thu ngẫu nhiên và hỗn hợp hạt thành một mẫu.
Những loài quả có ít hạt lấy số quả lớn hơn để đạt 2.500 – 5.000 hạt một mẫu, một số cũng không thể thu được 100 đến 1.000 hạt như vậy số hạt trên mẫu có thể nhỏ hơn.
Hạt nên thu từ những cây sạch bệnh, thu hạt hoặc quả đã chín hoàn toàn để đảm bảo sức sống của hạt nguồn gen.
Những quần thể biến động mạnh cần thu cỡ mẫu lớn hơn và có thể phân thành nhiều mẫu phụ từ một số phần thu thập dựa trên sự khác biệt của các mẫu. Đồng thời cần thu mẫu có lựa chọn bên cạnh thu mẫu ngẫu nhiên. Số lượng mẫu được Chang gợi ý năm 1985 như sau:
Bảng 2-5 : Loại quần thể, điểm và số mẫu thu thập theo Chang,1985
Kiểu quần thể Điểm/ngày Số cây (bông)/điểm
Ít cải tiến 20-40 15-30
Không cải tiến(Nguyên thủy) 10-20 30-50
Hoang dại 10-15 40-60
Giao phấn 10-15 30-60
Một số tác giả khác khuyến nghị lấy mẫu không ngẫu nhiên không nên hỗn hợp với mẫu ngẫu nhiên mà để riêng rẽ. Khuyến cáo cũng đề cập cần lấy nhiều điểm hơn trên một khu vực để thu được số hạt lớn hơn trên một điểm. Cán bộ thu thập cũng có thể điều chỉnh và lựa chọn phương pháp để tăng hiệu quả lấy mẫu vừa đạt được mục tiêu và phù hợp với khả năng, đặc biệt khi thực hiện thu thập trên một vùng rộng lớn và cây lâu năm như cây ăn quả, cây lấy rễ, cây lấy củ.
-Tổng lượng mẫu khô của một mẫu nguồn gen khi thu bằng hạt như sau:
-Những loại cây hạt nhỏ từ 50 -100g như hạt vừng, cải, rau giền
-Những loài cây hạt vừa thu từ 200- 250 g/ một mẫu nguồn gen hạt,
-Những loại cây hạt lớn từ 500g với hạt lớn hơn ( đậu ,lạc)
c) Khu vực thu thập tại một điểm
Theo Hawkes, 1980 có bốn địa điểm có thể thu được nguồn gen ở một khu vực là
-Ruộng nông dân
-Bếp và vườn hộ
-Chợ
-
Khu vực hoang dại tự nhiên
Mặc dù vậy, điểm thu thập quan trọng nhất là trên ruộng nông dân và nó cung cấp những quan sát chắc chắn về sức khỏe nguồn gen của giống địa phương, giống cũ, những cây lương thực chính và những cây trồng khác. Thu thập phụ thuộc vào địa phương, diện tích nông trại, những nơi còn canh tác tự cung, tự cấp có nguồn gen và đa dạng và giàu có hơn so với vườn hộ và chợ nhỏ. Thời điểm thu thập phù hợp nhất là trước mùa thu hoạch của nông dân.
d) Thu thập loài hoang dại họ hàng của các loài cây trồng
Thu thập họ hàng hoang dại của các loài cây trồng phụ thuộc vào nhu cầu của các nhà tạo giống và chương trình cải tiến cây trồng. Họ hàng hoang dại và các nhóm có liên quan sử dụng thuật ngữ của Harlan và de Wet (1971) có thể phân loại thành vốn gen sơ cấp, thứ cấp và tam cấp.
Các loài hoang dại trong vốn gen sơ cấp có thể lai với các giống trồng trọt, nhưng các loài trong vốn gen thứ cấp khó khăn hơn và vốn gen tam cấp chỉ sử dụng cho một số cây
trồng và giới hạn ở một số tính trạng di truyền. Các loài hoang dại biểu hiện tính dị hợp di truyền và không đồng nhất cao giữa các loại vật liệu di truyền, nhìn chung chúng có tỷ lệ giao phấn cao hơn các cây trồng đã thuần hóa hoặc mức độ đa bội, tự bất hợp cũng xảy ra mức cao hơn. Ví dụ loài lúa dại Oryza longistaminata là tự bất hợp trong khi biến dị này không tìm thấy ở lúa trồng.
Biến dị di truyền của các loài hoang dại cung cấp nguồn gen quý cho phát triển giống cây trồng như:
-Chống chịu sâu bệnh điều khiển bởi một số gen chủ yếu
-Chống chịu môi trường bất thuận như mặn, hạn, ngập, sương muối
-Sức sống của cơ quan sinh dưỡng cao như mía, khoai tây
-Hàm lượng protein cao ở sắn và yến mạch
-Hàm lượng dầu cao ở cọ dầu
-Độ dài sợi ở bông
-Thích nghi với điều kiện sinh thái như cây nho
-Rễ khỏe hơn của dứa
-Thân lớn hơn ở lúa mỳ
-Tỷ lệ sinh khối và sinh trưởng mạnh hơn và cho năng suất cao hơn ở cây ngũ cốc
-Hệ thống bất dục đực tế bào chất và khả năng phục hồi ở nhiều loài cây
-Các vốn gen loài hoang dại có thể chia làm hai nhóm dựa trên mức độ ưu tiên như sau:
Bảng 2-6: Phân loại vốn gen
Khai thác dễ ràng
Con cái hoang dại Có quan hệ mật thiết với cây trồng và thuộc vốn gen sơ cấp Các loài hoang dại
khác
Có quan hệ xã hơn thuộc vốn gen thứ cấp
Nhóm khó khai thác
Loài hoag dại Quan hệ xã hoặc không cùng chi thuộc vón gen tam cấp
Nhóm đại diện các loài hoang dại có liên quan đến cây trồng gồm chi trong đó có số lớn các loài và các biến dị khác biệt của các loài. Cần xem xét kỹ lưỡng để thu thập các nhóm phân bố trong tự nhiên gồm các loài đặc hữu, dạng hiếm và loài có nguy cơ đe dọa tuyệt chủng có phạm vi phân bố hẹp, cục bộ và biên độ sinh thái hẹp. Một số loài có phân bố rộng hơn, công việc thu thập có thể áp dụng chiến lược thu mẫu thuận lợi hơn như cỏ, cây thức ăn gia súc họ đậu, mức đa dạng tối đa có thể thu giữa 2.000 – 3.000m theo địa hình một mẫu.
Những khó khăn gặp phải khi thu thập loài hoang dại
-Biến động thời gian hạt chín giữa các loài lớn và ngay trong quần thể tự nhiên (ngay ở một điểm/địa phương) trong phạm vi phân bố của loài
-Mật độ quần thể, số quả , hạt trên cây không đáp ứng đủ vật liệu
-Hoa/quả có sự ngủ nghỉ, đặc biệt với cây quả thu mắt ngủ để nhân giống vô tính sinh dưỡng
Sự nhận biết các loài trên thực địa yêu cầu có kiến thức và kỹ năng về hệ thống phân loại thực vật, kiến thức sinh thái, địa lý và nhân chủng học cũng yêu cầu cán bộ thu thập nguồn gen hiểu biết về nguồn gen.
Thu thập nguồn gen hoang dại thường tốn nhiều lao động và thời gian để thu được các loài hay vật liệu hoang dại mong muốn. Các loài sinh trưởng ở đường hoặc vùng sinh thái riêng biệt khác nhau. Các loài đặc hữu và hiếm thường ở những nơi hiểm trở như đỉnh núi, hoang mạc...đôi khi phải thu hạt trên đỉnh những cây cao. Mức độ cao của lưu giữ nguồn gen hoang dại yêu cầu phân chia các loài hoang dại, nhận biết những tính trạng có giá trị, phù hợp với cây trồng nông nghiệp để duy trì bảo tồn những vật lệu này. Do vậy công việc thu thập nguồn gen hoang dại cần thiết mặc dù có nhiều khó khăn như đã trình bày trên
e) Chiến lược thu mẫu nguồn gen của Hawkes, 1980: Những điểm nổi bật
Thu thập hạt (Cây trồng và loài hoang dại)
-Thu từ (30-) 50 (-100) cá thể một điểm (50 hạt cho mỗi cây thu ngẫu nhiên trên cây).
-Mẫu ở các thời điểm khác nhau ghi rõ thời gian.
-Lựa chọn mẫu trên phạm vi rộng của môi trường có thể. Như vậy có thể thu được tất cả các allel với tần xuất 95% hay hơn của quần thể.
-Thay đổi phương thức thu thập nguồn gen hoang dại, ở những nơi quần thể thưa thớt thì mẫu cho một quần thể có thể trong phạm vi vài km2
-Nếu trong một quần thể có những biến động hình thái thì mỗi điểm lấy mẫu riêng rẽ chứ không áp dụng như một quần thể
-Nếu lấy mẫu theo đường chéo của một số hình thái không phải là mẫu ngẫu nhiên
-Lấy toàn bộ cụm hoa cũng như các hạt khi cần thiết như một chứng cứ
-Tạo phòng mẫu nơi có thể.
-Chụp ảnh.
-Ghi chép tỷ mỉ trên hiện trường.
Thu thập cơ quan sinh dưỡng:thu thập cơ quan sinh dưỡng với những loài cây trồng
-Mỗi mẫu phân biệt trong một làng/bản.
-Lặp lại theo khoảng thời gian trên một khu vực.
-Thu thập hạt bổ sung nếu có thể, phương pháp như với thu thập hạt.
-Thu thập cơ quan sinh dưỡng với các loài hoang dại
-Thu thập một chồi, mầm, cành giâm, cành chiết từ 10-15 cá thể và hỗn hợp thành mẫu, với cơ quan sinh dưỡng lớn có thể số mẫu nhỏ hơn từ diện tích khoảng 100 x 100 m.