Kiểm tra chất lượng hạt nguồn gen trước khi bảo tồn bao gồm kiểm tra giá trị gieo trồng, nảy mầm, sức sống, sức khỏe lô hạt nguồn gen. Các phương pháp kiểm tra sử dụng như phương pháp đánh giá chất lượng hạt giống cây trồng.
a) Đánh giá nảy mầm của nguồn gen
Phương pháp kiểm tra đánh giá nảy mầm sử dụng 3 phương pháp là trên giấy (trong đĩa petri, khay, hộp), phương pháp giữa các lớp giấy ẩm (giấy thấm, giấy xi măng) và phương pháp gieo trên cát. Mỗi loài cây trồng yêu cầu nền và điều kiện nảy mầm khác nhau, bảng dưới đây giới thiệu nền và điều kiện thử nảy mầm của một số loài cây trồng chủ yếu ( tham khảo chi tiết trong giáo trình sản xuất giống và công nghệ hạt giống)
Ngoài ba nền thử nảy mầm trên, phương pháp thử nảy mầm trên agar cũng sử dụng trong đánh giá nảy mầm của nguồn gen.
Agar là chất nền thay cho giấy để thử nảy mầm, đặc biệt với loại hạt nhỏ và trung bình rất hiệu quả, các bước thực hiện thử nảy mầm trên agar gồm
- Khử trùng bề mặt dụng cụ thử và lau bằng cồn 70 - 95% hoặc nhúng trong nước tẩy 20% hoặc nước sôi 10 - 15phút
- Dán nhãn lên đĩa petri 9 cm và đậy nắp (với hạt nhỏ) hoặc dụng cụ nảy mầm chịu nóng khác, ghi mã hiệu, số mẫu, số lần lặp lại và ngày thử nảy mầm.
Bảng 4-3: Hướng dẫn đánh giá tỷ lệ nảy mầm của những loài cây trông phổ biến ISTA,2005
hoặc AOSA,2005.
Cây trồng Loài Nền thử
nảy mầm Nhiệt độ (oC) Đếm lần đầu và lẫn cuối ( ngày)
Xử lý hạt tươi và hạt có ngủ nghỉ
Cỏ linh lăng Medicago sativa TP , BP 4; 7 Khía vỏ hạt cơ giới hạt vỏ
cứng
Nho hàng năm Medicago BP, TP 20 3; 7
Lúa mỳ Hordeum vulgare BP, S 20 4; 7 Xử lý lạnh 5oC hoặc 10oC trong 5 ngày trước khi thử Bầu nậm Lagenaria sieraria PT; S 20/30; 20 14
Bắp cải Brassica Oleracea
var. capitata TP; BT 20/30; 20 3 ; 10 Xử lý lạnh 5oC hoặc 10oC trong 3 ngày; KNO3 và ánh sáng
Ca rốt Daucus carota TP; BP 20/30; 20 6; 14 GA3 50ppm
Su lơ Brassica Oleracea
var. capitata TP; BP 20/30; 20 3; 10 Xử lý lạnh 5oC hoặc 10oC trong 3 ngày; KNO3 và ánh sang
Bông Gossypium spp. BP; S 20/30 ; 25 4; 12 làm xước, khía vỏ hạt cứng
Đậu bò Vigna unguiculata BP; S 20/30 ; 25 5; 8
Dưa chuột Cucumis satavus TP; BP 20/30 3; 7 Giữ chất nần trên một mặt phẳng khô
Cà tím Solanum
melongena TP; BP; S 20/30 7; 14 ánh sáng; KNO3
Ớt cay Capsicum
frutescens TP; BO 20/30 6; 14 ánh sáng; KNO3
Ngô Zea mays BP; S 20/30; 25; 20 4; 7 Đậu xanh Vigna radiata BP; S 20/30; 25 3; 7
Lạc Arachis hypogaea BP; S 20/30; 25 5; 10 Ethphon, 0,2%
Khoai tây Solanum
tuberosum TP; BP 20/30; 25 8; 16 GA3, 2000ppm
Bí ngô Cucurbita maxima BP; S 20/30;25 4; 7 Giữ chất nền trên mặt phẳng khô
Lúa Oryza sativa TP; BP; S 20/30; 25 5; 14 Phơi ở 40oC trong 5 ngày trước khi thử
Vừng Séamum indicum TP 20/30 3 ; 6
Cao lương Sorghum bicolor TP; BP 20/30; 25 3; 10 Xử lý lạnh 5oC hoặc 10oC trong 5 ngày
Đậu tương Glycine max BP; S 20/30; 25 5; 8 Bí xanh Cucurbita pepo;
C. moschata BP; S 20/30 4; 7 Giữ chất nền trên mặt phẳng khô
Dâu tây Fragaria ananassa TP 20/30; 20 28 ánh sáng
Hướng dương Helianthus annuus BP; S 20/30 3; 7
Thuốc lá Nicotiana tabacum TP 20/30 4; 14 ánh sang
Cà chua Lycopersicon
esculentum TP; BP 20/30 5; 14 ánh sang; GA3
Dưa hấu Citrullus lanatus BP; S 20/30;25 4; 14 Thửở 30oC; Giữ chất nền trên mặt phẳng khô
Hình 4-5: chuẩn bị, gieo hạt thử nảy mầm trên giấy trong đĩa petri
Hình 4-6: thử nảy mầm giữa các lớp giấy hay cuộn giấy
Hình 4-7 : thử nảy mầm trên cát
- Chuẩn bị dung dịch agar 1% (WA) bằng làm tan 1g bột hoặc sợi agar cho vào bình đun trong đó đã có 100ml nước cất ấm. Đun đến khi agar tan hoàn toàn, để nguội đến 50oC rót vào đĩa petri đã chuẩn bị có nhãn ghi thông tin. Độ dày agar gấp 2 lần độ dày hạt mẫu nguồn gen
- Gieo hạt lên bề mặt agar theo hàng, đậy nắp kín
- Đưa đĩa đã gieo hạt vào tủ thúc mầm với nhiệt độ phù hợp với mỗi loài nguồn gen - Tính tỷ lệ nảy mầm như các phương pháp khác
Hình 4-8 : Thử nảy mầm bằng gieo hạt trên agar
Ghi chú : đánh giá cây mầm bình thường và không bình thường chi tiết theo ISTA, 2003, 2005 hoặc AOSA,2005. Những chỉ tiêu để đánh giá mầm không bình thường như sau:
- Rễ: rễ cơ bản còi cọc, ngắn, mất, vỡ , tách đầu, mảnh, hướng xuống đất, màu nhạt không tươi, rễ ủng lan đến rễ cơ bản hoặc nhỏ hơn rễ thứ cấp ở cây 1 lá mầm.
- Mầm (trụ dưới lá mầm, trụ trên lá mầm, thân mầm): ngắn, dày, tách nứt, mất đoạn hoặc từng phần, xoắn vặn, ủng, suy tàn do bệnh
- Mầm và lá ở giai đoạn cuối nảy mầm: biến dạng, bị tổn thương, mất hoặc tàn do nhiễm bệnh
- Lá mầm : phồng, dị dạng, chết hoại, không tươi, chết hoại do nhiễm bệnh
Hình 4-9: Mầm bình thương và không bình thường của hạt đậu tương
b) Đánh giá sức sống hạt nguồn gen bằng Tetrazolium(TZ)
Đánh giá TZ có thể sử dụng để hỗ trợ nhận biết sức sống hạt nguồn gen và ưu việt hơn so với hạt thử nảy mầm khó thực hiện. Thử TZ cần bóc vỏ và mày của hạt, ngâm trong nước trung tính ở 30oC, những hạt không nảy mầm khi đánh gía nảy mầm ở giai đoạn cuối cùng của thử nảy mầm có thể đem sang đánh giá TZ. Đánh giá TZ thực hiện trong phạm vi độ pH từ 6 - 8.
Phương pháp chuẩn bị 1 lít dung dịch TZ để đánh giá như sau:
- Hòa tan 3,631g KH2PO4 (Potassium dihydrogen phosphate) trong 400 ml nước cất - Hòa tan 7,126 g Na2HPO4.2H2O (Disodiumhydrophophat) trong 600 ml nước cất - Trộn đều hai dung dịch trên tạo chất đệm
- Hòa tan 10g 2,3,5, triphenyl tetrazolium chloride trong 1 lít dung dịch đệm đã chuẩn bị trên để tạo dụng dịch gốc TZ = 0,5%. Trộn 1 phần dung dịch gốc với một phần nước tao dung dịch đanh giá, bảo quản dung dịch TZ trong tối và lạnh, nếu sử dụng trong thời gian ngắn
- Cắt đôi hạt theo chiều dài qua phôi bằng dao lam, bỏ đi một nửa nửa còn lại ngâm vào dung dịch TZ với nồng độ trên trong cốc thủy tinh hay đĩa petri
- Đặt cốc vào tủ định ôn trong tối, thời gian tùy loài, trung bình là 24 giờ - Sau ngâm rửa bằng nước sạch vài lần
- Ngâm hạt trong dung dịch lactophenol (1 lít lactophenol bằng 200 ml phenol, 200ml a xít lac tíc, 400 ml glycerin và 200ml nước) sau 1 - 2 giờ đánh giá
Bảng 4-4: Nồng độ, nhiệt độ và thời gian ngâm khi đánh giá bằng TZ (phụ lục I các cây trồng
của hiệp ước quốc tế PGRFA)
Cây trồng Loài Điều kiện trước khi thử Nồng độ, thời gan và nhiệt độ thử TZ Lúa mạch Hordeum vulgare Cho hút nước hoặc ngâm 6 - 18h 0,5%, 3h, 30oC Đậu Phaseolus spp Cho hút nước hoặc ngâm 18-24h 0,5-1%, 6-24h, 30oC Cải Brassica spp Cho hút nước 16-18h sau ddos
ngaam 2 - 3 h 0,5-1%, 3-6h, 30 oC Cà tím Solanum melongena Cho hút nước hoặc ngâm 18h 0,5-1%, 6-24h, 30oC Ngô Zea mays Cho hút nước hoặc ngâm 18h 0,5-1%, 2-6h, 30oC Lúa Oryza sativa Cho hút nước hoặc ngâm 18h 0,5%, 3h, 30oC Hướng
dương
Helianthus annuus Cho hút nước hoặc ngâm 18h 0,5-1%, 3-6h, 30oC
Đánh giá mô chuyển màu bằng kính hiển vi thường
- Mô sống chuyển màu đỏ sáng, nếu màu tía hay đỏ tối là mô chết - Hạt chuyển màu hoàn toàn là hạt có sức sống
- Không chuyển màu là hạt hư hỏng không còn sức sống (vigor)
- Chuyển màu từng phần sẽ tạo ra mầm bình thường hoặc không bình thường tùy thuộc vào kiểu đổi màu
Hình 4-10: Đổi màu của hạt khi đánh giá bằng TZ hạt cây 2 lá mầm, số 1 - 6 là hạt có khả
năng nảy mầm, 7 - 15 là những hạt không có khả năng nảy mầm
c) Đánh giá sức khỏe hạt nguồn gen
Đánh giá sức khỏe nguồn gen chủ yếu đánh gía sự nhiễm hoặc không nhiễm bệnh của hạt. Mẫu nguồn gen thu thập trên đồng ruộng với rất nhiều loài sâu, bệnh tự nhiên chúng có thể tồn tại trên vỏ hạt hoặc ký sinh trong nội nhũ và trong phôi hạt. Để bảo đảm cho mẫu nguồn gen sạch sâu, bệnh hại cần phải đánh giá trước khi đưa vào bảo tồn. Đánh giá kiểm tra nấm, vi khuẩn, virus và côn trùng trong lô mẫu hạt nguồn gen.
Phương pháp đánh giá lấy mẫu cho 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 100 hạt và tổng số hạt kiểm tra là 400 hạt, nếu quá 5% số hạt nhiễm bệnh mẫu nguồn gen đó không phù hợp để bảo tồn.
Phương pháp kiểm tra chủ yếu bằng:
- Quan sát trực tiếp phát hiện côn trùng, trứng, vết bệnh, sợi nấm trên hạt
- Đánh giá trên triệu chứng cây con, trồng hạt trong nhà kính đã vệ sinh và khử trùng, khi hạt nảy mầm trên cây con xuất hiện triệu chứng xác định bệnh (trong trường hợp số hạt đủ lớn để gieo trồng và còn đủ hạt cho bảo tồn)
- Kỹ thuật rửa hạt: kiểm tra nấm bệnh trên vỏ hạt như nấm, mốc, nấm bột, rỉ sắt... cho 2 g hạt vào ống kiểm tra, cộng thêm 2 ml nước cất, lắc đều 5 - 10 phút. Cho vào máy ly tâm 200 vòng phút trong 10 phút và quan sát phần lắng động bằng kính hiển vi cấu trúc của nấm
- Phương pháp nuôi cấy trên bàn thấm hay trên agar là phương pháp đơn giản và không tốn kém để phát hiện nấm khi hình thành bào tử
- Trên bàn thấm giống như phương pháp nảy mầm, đặt 20 - 25 hạt trên lớp giấy mềm tên đĩa petri có độ ẩm bằng nước cất, gặn bỏ nước thừa đưa vào tủ định ôn điều kiện phù hợp cho sinh trưởng của nấm, ánh sáng cận cực tím và chu kỳ xen kẽ sang tối tại 20±2oC trong 7 ngày. Kiểm tra giấy trên đĩa petri bằng kính hiển vị nổi, nhận biết và đánh giá thông qua quan sát sự phát triển của nấm trên hạt.
- Đánh giá như trên một số trường hợp, hạt nảy mầm che lấp nấm bệnh có thể khắc phục bằng cộng thêm muối 2,4-D sodium 0,2%
- Phương pháp trên đĩa agar : là phương pháp phổ biến nhất kiểm tra bệnh nấm hạt giống, loại nấm khác nhau ngay cả nòi khác nhau yêu cầu cho sinh truởng và phát triển bào tử. Ánh sáng cận cực tím có bước sóng 300 - 380nm gọi là ánh sáng đen. Môi trường đơn giản là phối hợp rau, các bon hydrát đường và agar hỗn hợp được đun trộn agar với rau nếu không có môi trường thương mại. Môi trường thông dụng là nước khoai tây gluco agar và agar bột lúa mạch. Trộn 1 g bột khoai tây dextrose (tên thường gọi là gluco, d- gluco) trong 100 ml nước cất, khử trùng trong nồi hấp 15 - 20 phút sau làm lạnh đến 50oC, rót dung dịch trên lên đĩa petri đã khử trùng, tránh nhiễm bẩn, làm lạnh tiếp đến khi đông cứng bề mặt trong 20 phút. Khử trùng bề mặt hạt trước khi kiểm tra nấm bệnh bằng sodium hypochlorite (NaOCl) 1%, Dung dịch NaOCL pha loãng bằng 20 phần nước tẩy (5% NaOCl) với 80 phần nước. Đặt khoảng 10 hạt ( tùy thuộc cỡ hạt) lên mặt agar và ghim lên bề mặt bằng các kẹp ghim. Đưa đĩa đã cấy hạt vào tủ định ôn 20 - 25oC trong 5 - 8 ngày. Nhận biết nguồn bệnh trên cơ sở sợi nấm và bào tử phát triển trên bề mặt agar
- Phương pháp PCR: PCR là một kỹ thuật khuyếch đại một lượng nhỏ của chuỗi nucleotide đặc thù theo bội số với sự có mặt của chuỗi mẫu với 2 mồi oligonucleotide gắn với sợi ngược và sợi bên vùng DNA mục tiêu. Phản ứng là chu kỳ liên quan đến sự biến tính mẫu mồi hồi tính DNA và mở rộng mồi hồi tính bằng polymere DNA đến khi đủ bản sao để phân tích tiếp theo. PCR cho phép dò tìm số lượng rất nhỏ của bệnh trong mẫu nguồn gen bằng khuyếch đại chuỗi bệnh đến mức có thể dò tìm, phương pháp này hữu ích chuẩn đoán bệnh nhanh, chính xác nhưng tốn kém, nó có thể dò tìm bất kỳ tổ chức sống nào có DNA bằng điều khiển dương tính hoặc âm tính để so sánh
- Kiểm tra sức khỏe hạt mẫu nguồn gen bằng ELISA: phương pháp ELISA (Enzyme-link immunosorbern assay), sử dụng protein gọi là kháng thể để chuẩn đoán bệnh cây trồng. Chuẩn đoán trên cơ sở khả năng của kháng thể phản ứng với một kháng nguyên gây ra kết tủa. Kháng thể là một protein tinh khiết cao, tạo ra bằng tiêm kháng nguyên vào động vật máu nóng như chuột, máu động vật sẽ sinh ra kháng thể, có nhiều loại ELISA để chuẩn đoán sự có mặt của protein. Nhưng hai phương pháp phổ biến là kháng nguyên tạo màng vỏ (ACP-ELISA) và chuẩn đoán miễn vết mô ( TBIA)
d) Kiểm tra sự trao đổi gen ngẫu nhiên
Trao đổi gen là các gen đưa vào cơ quan hoặc loài khác thông qua kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Với thực vật, thực hiện trao đổi trong bộ genome và di truyền đến con cái của chúng thông qua con đường sinh sản bình thường. Một trong những hợp phần quan trọng của quản lý ngân hàng gen là kiểm tra sự có mặt của một gen hay kiểu hình. Đây là yêu cầu đối với
kiểm tra độ thuần, độ sạch của nguồn gen trước khi bảo tồn và cũng là yêu cầu vệ sinh an toàn sinh học, khi xuất hay nhập khẩu nguồn gen. Sự trao đổi gen cũng liên quan đến sở hữu trí thuệ của nguồn gen và vấn đề xã hội đối với các sản phẩm trao đổi gen như vậy. Trong quá trình thu thập nguồn gen luôn có liên quan đến trao đổi gen của các vật liệu, những trao đổi gen ngẫu nhiên gồm những loài các cây giao phấn, những loài cây này có khả năng trao đổi gen cao, những cây tự thụ phấn và cây sinh sản vô tính khả năng trao đổi gen thấp, chỉ cần kiểm tra những giai đoạn đầu. khả năng trao đổi gen mức trung bình những cây trồng còn lại
Ngân hàng gen nên có những bước thực hiện kiểm tra trước để hạn chế các gen ngoại lai trong nguồn bảo tồn Ex situ, các mẫu nguồn gen không yêu cầu kiểm tra là các loài không chuyển gen, mẫu không chuyển gen thương mại, mẫu có chuyển gen nhưng quản lý tốt. Hai phương pháp kiểm tra cơ bản trao đổi gen của mẫu nguồn gen là ELISA và PCR để kiểm tra sự có mặt của gen ngoại lai, các kit kiểm tra có sẵn trên thị trường.
Sau khi thu nhận, làm sạch, kiểm tra nguồn gen cần nhập tất cả các thông tin vào file cơ sở dự liệu chi tiết đến mức có thể như: số liệu ban đầu, số liệu làm khô, làm sạch, kiểm tra nảy mầm, sức sống và sức khỏe hạt nguồn gen. Thông tin yêu cầu đầy đủ về phương pháp, kết quả phân tích cuối cùng, ngày thực hiện các hoạt động chuẩn bị nguồn gen.