Lúa là đối tƣợng cây trồng đƣợc quan tâm nghiên cứu từ rất sớm và hƣớng nghiên cứu chuyển gen vào lúa đã có những thành cơng quan trọng từ cuối những năm 1980. Các nhà nghiên cứu đã phát triển phƣơng pháp chuyển gen lúa sử dụng xung điện và polyethylene glycol (PEG) vào năm 1988, năm 1991 đã chuyển đƣợc gen vào lúa bằng súng bắn gen và đến năm 1993 đã thành công trong việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen vào lúa Oryza sativa L. ssp.
japonica. Mặc dù phƣơng pháp chuyển gen sử dụng A. tumefaciens sau đó đã đƣợc
cải tiến rất nhiều nhƣng vấn đề chuyển gen vào giống lúa nhóm Indica vẫn là một thách thức lớn với các nhà nghiên cứu. Năm 2008, Hiei và Komari đã
phát triển một phƣơng pháp chuyển gen vào lúa Indica bằng cách sử dụng phôi non và thu đƣợc hiệu quả rất cao (5 – 13 thể biến nạp/phôi non). Tuy nhiên, nhƣợc điểm lớn nhất của phƣơng pháp này đó là khó thu thập đƣợc phôi non [24].
Với những thành công trong nghiên cứu quy trình chuyển gen vào lúa, hiện nay các nhà khoa học có thể dễ dàng chuyển một gen ngoại lai vào một giống lúa bất kỳ. Tuy nhiên, để phục vụ cho các mục đích nghiên cứu khác nhau, một số kỹ thuật chuyển gen lúa cải tiến đã đƣợc phát triển, ví dụ nhƣ chuyển đa gen, biểu hiện gen đặc hiệu mô/cảm ứng điều kiện môi trƣờng và chuyển gen vào lục lạp [24].
1.4.1.1. đa gen
đa gen là phƣơng pháp chuyển đồng thời nhiều gen ngoại lai vào cùng một đối tƣợng giống lúa. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng khi cần chuyển nhiều gen
tiềm năng một lúc để nghiên cứu đánh giá chức năng. Khi đó, việc chuyển đồng thời nhiều gen bằng một cấu trúc Ti-plasmid duy nhất với một lần thực hiện thao tác gen có ý nghĩa rất lớn, giúp tiết kiệm rất nhiều thời gian, cơng sức và chi phí. Hiện nay các giống cây lƣơng thực chuyển gen thƣơng mại đều đƣợc chuyển một gen đơn lẻ để kiểm sốt tính trạng chất lƣợng, ví dụ nhƣ kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ hay kháng bệnh. Tuy nhiên, có rất nhiều tính trạng đƣợc quy định bởi hai hay nhiều gen. Chính vì vậy, để kiểm sốt đƣợc các tính trạng đa gen thì phải chuyển đồng thời nhiều gen vào cùng một đối tƣợng. Bên cạnh đó, phƣơng pháp này cũng cần thiết trong trƣờng hợp cần tạo ra một con đƣờng trao đổi chất mới với nhiều gen tham gia. Ví dụ nhƣ giống lúa có hạt gạo màu vàng đƣợc tạo ra nhờ chuyển hai gen ngoại lai để thiết lập một con đƣờng sinh tổng hợp β-carotenoid mới [24, 125].
Có hai phƣơng thức để đa gen vào thực vật. Cách thứ nhất là thiết kế nhiều vector nhị phân, mỗi vector mang một gen đích. Các cấu trúc mang gen sau đó sẽ đƣợc chuyển đồng thời hoặc chuyển lần lƣợt từng cấu trúc vào cùng một dịng cây. Ngồi ra cũng có thể chuyển riêng từng cấu trúc vào các dòng cây khác nhau, sau đó kết hợp với phƣơng pháp lai để tạo ra tổ hợp lai mang nhiều gen đích. Cách thứ hai là thiết kế một vector duy nhất mang đồng thời nhiều gen đích để chuyển gen đồng thời. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tiết kiệm rất nhiều thời gian và chi phí; tuy nhiên hạn chế lớn nhất đó là rất khó để chuyển một đoạn DNA kích thƣớc lớn vào tế bào thực vật. Các Ti-plasmid thơng thƣờng, ví dụ nhƣ hệ vector pCAMBIA chỉ mang đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc tối đa 20 kb tƣơng ứng với khoảng 2 – 3 gen ngoại lai. Để khắc phục vấn đề này, một số Ti-plasmid đặc biệt đã đƣợc thiết kế, ví dụ nhƣ hệ vector BIBAC hay TAC, có khả năng mang các đoạn DNA có kích thƣớc hơn 100 kb [24].
1.4.1.2. Biểu hiện gen đặc hiệu mô/cảm ứng điều kiện môi trường
Trong nghiên cứu chuyển gen vào lúa, promoter CaMV 35S và Ubiquitin là hai loại đƣợc sử dụng nhiều nhất. Tuy nhiên, việc sử dụng các promoter hoạt động mạnh và liên tục này có những hạn chế nhất định. Do gen đích đƣợc biểu hiện liên tục ở tất cả các mô/cơ quan và ở tất cả các giai đoạn phát triển nên sẽ gây tiêu tốn
năng lƣợng, tăng g nh nặng cho bộ máy trao đổi chất. Bên cạnh đó, việc tích lũy sản phẩm protein của gen đích đối với nhóm cây chuyển gen lƣơng thực cũng liên quan tới vấn đề an toàn thực phẩm. Ngoài ra, sự biểu hiện của một số gen mã hóa nhân tố phiên mã điều hòa đáp ứng stress môi trƣờng thƣờng ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây. Chính vì vậy, việc sử dụng các promoter cảm ứng đặc hiệu mơ/cơ quan có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu tạo giống cây trồng chuyển gen [24]. Một số nghiên cứu về promoter ở lúa đã xác định đƣợc những promoter tiềm năng có thể ứng dụng trong chuyển gen chống chịu điều kiện bất lợi của mơi trƣờng, ví dụ nhƣ Lip9, OsNAC6, Oshox24 [85]. Jeonga và nhóm
nghiên cứu [51] cũng đã thử nghiệm khả năng chống chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen OsNAC10, sử dụng promoter biểu hiện đặc hiệu ở mô rễ RCc3. Kết
quả thử nghiệm cho thấy dòng lúa chuyển gen có sản lƣợng cao hơn đáng kể so với dòng đối chứng trong điều kiện khô hạn. Bằng cách sử dụng promoter rbcs,
Ye và nhóm nghiên cứu đã tạo đƣợc dịng lúa chuyển gen cry1C chỉ biểu hiện ở
các phận có màu xanh, ví dụ lá và thân (đích tấn cơng của cơn trùng và sâu bọ), giúp giảm thiểu nguy cơ về an toàn thực phẩm liên quan tới protein Bt [124].
1.4.1.3. Chuyển gen vào lục lạp
Chuyển gen vào lục lạp là kỹ thuật đƣa vector mang gen đích vào lục lạp bằng phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp, ví dụ nhƣ sử dụng súng bắn gen. Gen chuyển sẽ đƣợc chèn vào hệ gen lục lạp nhờ cơ chế tái tổ hợp tƣơng đồng. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là hiệu quả chuyển gen rất cao với số bản sao gen chuyển có thể đạt 10.000 bản sao trong mỗi tế bào. Bên cạnh đó, cây đƣợc chuyển gen bằng phƣơng pháp này có khả năng tích lũy sản phẩm protein của gen chuyển rất cao (có thể tới 47% hàm lƣợng protein tổng số). Chính vì vậy, hiệu quả biểu hiện gen của phƣơng pháp chuyển gen lục lạp cao hơn rất nhiều so với phƣơng pháp chuyển gen vào nhân. Ngoài ra, phƣơng pháp này cũng an toàn và thân thiện với môi trƣờng hơn do gen chuyển trong hệ gen lục lạp khơng có khả năng di truyền, tránh đƣợc sự lan truyền của gen ngoại lai trong quần thể khi thử nghiệm trên quy mô đồng ruộng. Một ƣu điểm khác của phƣơng pháp chuyển gen lục lạp là có thể kiểm sốt đƣợc vị
trí gen đích đƣợc chèn vào trong hệ gen lục lạp, vì vậy các thể biến nạp sinh ra đồng nhất về mặt di truyền, đồng thời không xảy ra hiện tƣợng bất hoạt gen. Hơn nữa, do các gen của lục lạp thƣờng đƣợc sắp xếp theo cấu trúc operon nên có thể biểu hiện nhiều gen chuyển chỉ với một promoter duy nhất [24].