Thành phần Nồng độ/ Hàm lƣợng Môi trƣờng MS-T Môi trƣờng MS-R Muối MS 1 X 1 X Vitamin MS 1 X 1 X Sucrose 30 mg/l 30 mg/l Myoinositol 100 mg/l - Casein - 0,3 g/l L-Proline - 0,65 g/l Agar 8 g/l 8 g/l
Để chuyển cấu trúc biểu hiện gen vào thuốc lá, lá cây thuốc lá đƣợc cắt thành các mảnh nhỏ (0,5 – 1 cm2) và ngâm trong bình chứa mơi trƣờng MS-T lỏng có pH 5,8. Bình ni cấy đƣợc ủ ở 28oC trong điều kiện tối hoàn toàn trong 2 ngày. Một khuẩn lạc A. tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen đã đƣợc trẻ hóa từ mơi
trƣờng LB đặc đƣợc hòa tan trong 5 ml môi trƣờng YEM chứa Kanamycin (50 µg/ml), Streptomycin (50 µg/ml), Rifampicin (20 µg/ml) và ni lắc ở 28oC qua đêm. Tiếp theo, 4 ml môi trƣờng nuôi cấy sơ cấp đƣợc bổ sung vào bình chứa 100 ml mơi trƣờng YEM mới và nuôi lắc ở 28oC qua đêm. Tế bào đƣợc thu lại bằng cách ly tâm dịch nuôi cấy thứ cấp ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút và đƣợc hòa tan trở lại trong dung dịch MS-T có pH 5,2 (mơi trƣờng MS-T không chứa agar) đến khi OD600 đạt giá trị 0,6 – 0,8. Các mảnh lá đƣợc chuyển vào ống chứa
dung dịch tế bào; dung dịch Acetosyringone đƣợc bổ sung vào ống đến nồng độ 100 µM và đƣợc ủ trong 15 phút. Các mảnh lá sau đó đƣợc làm khơ bằng giấy thấm và chuyển lên đĩa môi trƣờng MS-T đồng ni cấy có pH 5,2 (mơi trƣờng MS cơ bản chứa Acetosyringone 100 µM, BAP 1 mg/l, NAA 1 mg/l); đĩa đƣợc ủ ở 28oC trong tối 3 ngày. Các mảnh lá tiếp tục đƣợc chuyển sang mơi trƣờng MS-T chọn lọc có pH 5,8 (môi trƣờng MS cơ bản đƣợc bổ sung BAP 1 mg/l, NAA 1 mg/l, Cefotaxime 250 mg/l, Hygromycin 30 mg/l) và đƣợc ủ ở 28o
C trong 1 tuần với điều kiện tối hoàn toàn và trong 3 tuần với điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Chồi tái sinh từ mô sẹo đƣợc cắt và chuyển sang nuôi cấy trên môi trƣờng MS-T chọn lọc mới cho đến khi đạt chiều cao 2 – 3 cm thì chuyển sang mơi trƣờng MS-T tạo rễ có pH 5,8 (mơi trƣờng MS cơ bản đƣợc bổ sung Cefotaxime 250 mg/l, Hygromycin 30 mg/l). Cây tái sinh đƣợc ni cấy đến khi hình thành bộ rễ đầy đủ thì đƣợc chuyển sang trồng trong chậu đất mùn ẩm đƣợc bọc kín bằng nilon. Sau 1 tuần, chậu đất đƣợc tháo bỏ nilon. Cây tiếp tục đƣợc giữ trên đất mùn thêm 2 ngày trƣớc khi đƣợc sang chậu đất lớn để trồng trong điều kiện nhà kính đến khi ra hoa, kết quả và thu hạt.
2.2.7.3. Chuyển nạp gen vào lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Để chuẩn bị nguyên liệu thực vật, hạt đƣợc rửa bằng H2O cất khử trùng (2 lần) và khử trùng bằng dung dịch ethanol 70% trong 2 phút và dung dịch NaOCl 3% trong 30 phút. Sau đó, hạt lúa đƣợc rửa lại bằng H2O cất khử trùng (10 lần) và đƣợc làm khô trên giấy thấm. Hạt khử trùng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS-R tạo mơ sẹo có pH 5,8 (mơi trƣờng MS-R cơ bản đƣợc bổ sung 2,4-D 2,5 mg/l và BAP 0,15 mg/l) ở 28oC trong điều kiện tối hoàn toàn trong 3 tuần. Mơ sẹo hình thành từ phơi đƣợc cắt và chuyển sang môi trƣờng MS-R tạo mô sẹo mới để tiếp tục nuôi cấy thêm 5 – 7 ngày trƣớc khi đƣợc sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen.
Để chuyển cấu trúc biểu hiện gen vào mô sẹo của lúa, một khuẩn lạc A. tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen đã đƣợc trẻ hóa từ mơi trƣờng LB đặc đƣợc
hòa tan trong 5 ml YEM chứa Kanamycin (50 µg/ml), Streptomycin (50 µg/ml), Rifampicin (20 µg/ml) và đƣợc ni lắc ở 28oC qua đêm. Sau đó, 4 ml mơi trƣờng ni cấy sơ cấp đƣợc bổ sung vào bình chứa 100 ml YEM mới và nuôi lắc ở 28oC
qua đêm. Tế bào đƣợc thu lại bằng cách ly tâm dịch ni cấy thứ cấp ở tốc độ 4.000 vịng/phút trong 15 phút và đƣợc hòa tan trở lại trong dung dịch MS-R có pH 5,2 (môi trƣờng MS-R không chứa agar) đến khi OD600 đạt giá trị 0,6 – 0,8. Mô sẹo đƣợc chuyển vào bình thủy tinh chứa dung dịch tế bào; dung dịch Acetosyringone đƣợc bổ sung vào bình đến nồng độ 200 µM; bình đƣợc lắc mạnh trong 30 phút. Mơ sẹo sau đó đƣợc làm khơ trên giấy thấm và đƣợc ni cấy trên môi trƣờng MS-R đồng nuôi cấy có pH 5,2 (mơi trƣờng MS-R tạo mơ sẹo chứa Acetosyringone 200 µM) ở 28oC trong tối 3 ngày. Mô sẹo đƣợc chuyển vào bình chứa H2O khử trùng, kháng sinh Cefotaxime đƣợc bổ sung vào bình đến nồng độ 250 mg/l. Hỗn hợp đƣợc lắc mạnh trong 1 phút và phần dung dịch chứa vi khuẩn đƣợc đổ bỏ. Bƣớc rửa này đƣợc lặp lại 10 lần; sau đó mơ sẹo đƣợc làm khơ bằng giấy thấm. Tiếp theo, mô sẹo đƣợc chuyển sang ni cấy trên mơi trƣờng MS-R chọn lọc có pH 5,8 (mơi trƣờng MS-R tạo mô sẹo chứa Cefotaxime 250 mg/l và Hygromycin 50 mg/l) ở 28oC trong điều kiện tối hoàn tồn (3 tuần chuyển mơi trƣờng mới 1 lần). Phần mơ sẹo cịn sống sau 3 lần chọn lọc đƣợc tiếp tục ni cấy trên mơi trƣờng MS-R tiền tái sinh có pH 5,8 (mơi trƣờng MS-R chứa NAA 2 mg/l, BAP 3 mg/l, ABA 5 mg/l, Cefotaxime 250 mg/l và Hygromycin 30 mg/l) trong tối 1 tuần trƣớc khi chuyển sang môi trƣờng MS-R tái sinh pH 5,8 (môi trƣờng MS cơ bản đƣợc bổ sung NAA 2 mg/l, BAP 3 mg/l, Cefotaxime 250 mg/l, Hygromycin 30 mg/l). Môi trƣờng tái sinh mô sẹo đƣợc ủ ở 28oC với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày tới khi xuất hiện chồi tái sinh. Chồi tái sinh sau đó đƣợc chuyển sang mơi trƣờng MS-R tái sinh mới và tiếp tục đƣợc nuôi cấy tới khi chồi đạt kích thƣớc 3 – 5 cm thì chuyển sang môi trƣờng MS-R tạo rễ (môi trƣờng MS-R chứa Cefotaxime 250 mg/l, Hygromycin 50 mg/l). Cây tái sinh đƣợc nuôi cấy ở điều kiện 28oC với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày tới khi hình thành bộ rễ đầy đủ. Cây non sau đó đƣợc rửa sạch, ngâm rễ trong ống thủy tinh chứa nƣớc có nắp đậy kín trong 2 ngày và ống mở nắp trong 5 ngày. Cuối cùng, cây non đƣợc chuyển sang trồng trong chậu đất lớn trong điều kiện nhà kính đến khi thu hạt.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN BẤT LỢI Ở LÚA
3.1.1. Tổng hợp thƣ viện cDNA thứ cấp
Trong nghiên cứu sàng lọc gen mã hóa protein liên kết với các đoạn DNA đích JRC0332 và JRC0528, nguồn nguyên liệu đƣợc sử dụng là thƣ viện cDNA sơ cấp đƣợc đóng gói trong hệ gen của λ phage, có bản chất là một vector kép (HybriZAP-2.1) kích thƣớc khoảng 50 kb, chứa một vector biểu hiện khác (pAD- GAL4) có kích thƣớc nhỏ hơn (khoảng 7,1 kb) (Hình 2.4). Để phục vụ mục đích biểu hiện các dịng cDNA trong nấm men, chúng tơi đã tiến hành “cắt” vector pAD- GAL4 mang các dịng cDNA từ vector HybriZAP-2.1 và khuếch đại in vivo trong vi khuẩn E. coli. Phagemid pAD-GAL4-cDNA sau đó đƣợc tinh sạch và tiến hành
kiểm tra nồng độ và kích thƣớc thƣ viện cDNA thứ cấp tạo đƣợc.
Hình 3.1: Chuẩn hố nồng độ thƣ viện cDNA thứ cấp
Ghi chú: Tế bào E. coli mang phagemid pAD-GAL4 được cấy trải trên mơi trường LB có
Ampicillin 100 µg/ml. Dung dịch phagemid pAD-GAL4 được pha lỗng theo tỉ lệ 1:10 (A),
1:102 (B) và 1:103 (C). Mỗi khuẩn lạc đại diện cho một phagemid.
Kết quả xác định nồng độ thƣ viện cDNA thu đƣợc cho thấy tại nồng độ pha lỗng mẫu phagemid 1:103, mơi trƣờng ni cấy xuất hiện 49 khuẩn lạc (Hình 3.1), tƣơng ứng với nồng độ phagemid đạt xấp xỉ 5 x 106
cfu/ml. Để đánh giá kích thƣớc của các đoạn cDNA trong thƣ viện cDNA thứ cấp, một số khuẩn lạc trên môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc đã đƣợc chọn ngẫu nhiên để tiến hành kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi AD-Fw/AD-Rv đặc hiệu cho vector pAD-GAL4 (Bảng 2.1). Kết quả điện di sản phẩ ấy sự xuất hiện
của các băng DNA có kích thƣớc dao động từ 0,2 – 2,0 kb (Hình 3.2), chứng tỏ thƣ viện cDNA thứ cấp mang các đoạn cDNA có kích thƣớc dao động từ 0,2 – 2,0 kb.
Hình 3.2: Kiểm tra thƣ viện cDNA thứ cấp bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc
Ghi chú: Sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lạc mang các dòng cDNA khác nhau được điện di
trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1 – 11: khuôn là các khuẩn lạc; giếng 12: đối chứng âm (khơng có DNA khn).
Theo quy trình sàng lọc gen bằng kỹ thuật Y1H, nồng độ thƣ viện tối thiểu cần đạt từ 105 –106 cfu/ml và có mang các đoạn cDNA có kích thƣớc từ 0,5 – 2 kb [27]. Nhƣ vậy, thƣ viện cDNA thứ cấp chúng tôi tạo đƣợc trong nghiên cứu này đảm bảo yêu cầu để sử dụng cho thí nghiệm sàng lọc gen bằng kỹ thuật Y1H.
3.1.2. Phân lập gen mã hoá nhân tố phiên mã bằng kỹ thuật Y1H
3.1.2.1. Thiết kế vector chỉ thị mang đoạn DNA đích
Kỹ thuậ ất phổ biến trong phân lập và nghiên cứu chức năng của nhân tố phiên mã. Đối với thí nghiệm sàng lọc thƣ viện cDNA bằng Y1H, việc xác định trình tự của đoạn DNA đích có ý nghĩa quyết định sự thành cơng của thí
nghiệm. Trong nghiên cứ ịnh trình tự dựa trên cơ
sở các kết quả nghiên cứu của Rabbani và nhóm nghiên cứu về mơ hình biểu hiện của một số gen ở lúa trong các điều kiện stress phi sinh học khác nhau [96]. Khi phân tích trình tự promoter của tất cả các gen cảm ứng stress này, ngồi một số yếu tố hoạt hố
cis liên quan tới điều hồ hoạt động gen đã đƣợc cơng bố nhƣ DRE, ABRE, NACRS,
W-box và G-box, hai motif có trình tự là CCTCCTCC và CTCCAC đƣợc tìm thấy xuất hiện lặp lại nhiều lần trong vùng promoter của nhiều gen và đƣợc dự đoán là những yếu tố cis điều hòa biểu hiện gen trong điều kiện stress. Đặc biệt, vùng
promoter của hai gen JRC0528 (cảm ứng stress hạn, mặn, lạnh, ABA) và JRC0332
(Phụ lục 2). Chính vì vậy, chúng tơi đã sử dụng hai đoạn DNA kích thƣớc 50 bp đƣợc tổng hợp hóa học dựa trên trình tự của hai promoter JRC0528 và JRC0332 có cả chứa hai motif này, đặt tên là JRC0332 và JRC0528, làm “mồi câu” trong thí nghiệm sàng lọc gen mã hoá nhân tố phiên mã từ thƣ viện cDNA bằng kỹ thuật Y1H (Hình 3.3A).
Hình 3.3: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện trong nấm men
Ghi chú: (A) Trình tự nucleotide của hai đoạn DNA đích JRC0332 và JRC0528. (B) Sơ đồ
thiết kế vector biểu hiện mang thư viện cDNA (pAD-GAL4/cDNA) và vector chỉ thị mang gen chỉ thị HIS3 và lacZ.
Theo hƣớng dẫn của hãng Clontech, vector chỉ thị dùng cho thí nghiệm sàng lọc thƣ viện cDNA bằng Y1H cần mang tối thiểu 2 trình tự DNA lặp lại [27]. Tuy nhiên, để tăng cƣờng khả năng tƣơng tác đặc hiệu giữa nhân tố phiên mã và yếu tố
cis, rất nhiều nghiên cứu tƣơng tự trƣớc đây đã sử dụng 4 trình tự DNA lặp lại làm
“mồi” để “câu” gen mã hoá nhân tố phiên mã [77, 94, 112, 113]. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tơi cũng sử dụng hai đoạn DNA đích, mỗi đoạn mang 4 trình tự DNA 50 bp lặp lại có chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC (Hình 3.3B).
Tron ( chƣa công bố), Phạm Xuân Hội và
nhóm nghiên cứu đã ghép nối hai đoạn DNA mang 4 trình tự lặp lại của hai đoạn DNA đích JRC0332 và JRC0528 vào vùng promoter điều khiển hai gen chỉ thị
HIS3 và lacZ trên hai vector chỉ thị pHISi và pLacZi (Hình 3.3B, Phụ lục 1). Sự có
mặt của trình tự DNA trong vector tái tổ hợp đã đƣợc khẳng định lại bằng phƣơng pháp PCR (Phụ lục 3) và giải trình tự nucleotide (số liệ ).
Các cấu trúc biểu hiện gen chỉ thị HIS3 và lacZ mang 4 đoạn DNA đích lặp lại JRC0332 và JRC0528 đƣợc chèn vào hệ gen tế bào nấm men S. cerevisiae
YM4271 và khảo sát mức độ biểu hiện nền của gen chỉ thị trong thể biến nạp. Kết quả khảo sát mức độ biểu hiện nền đã cho thấy sự biểu hiện của hai gen chỉ thị lacZ và HIS3 đều ở mức độ thấp, trong đó thời gian ủ cơ chất tối đa để đánh giá hoạt tính β-galactosidase đƣợc xác định là 60 phút (đối với gen lacZ) và nồng độ 3-AT tối thiểu trong môi trƣờng khuyết dƣỡng chọn lọc đƣợc xác định là 10 mM (đối với gen
HIS3) (Phụ lục 4 & Phụ lục 5). Do đó, cả hai gen chỉ thị ể xác định tƣơng tác DNA-protein trong thí nghiệm sàng lọc thƣ viện cDNA.
3.1.2.2. Sàng lọc thư viện cDNA xử lý điều kiện bất lợi của lúa
Để sàng lọc gen mã hoá protein có khả năng liên kết đặc hiệu với hai đoạn DNA đích JRC0332 và JRC0528, 20 µg plasmid thƣ viện cDNA thứ cấp (pAD- GAL4/cDNA) đƣợc biến nạp lần lƣợt vào tế bào nấm men S. cerevisiae YM4271 tái tổ hợp mang cặp vector chỉ thị pHISi/JRC0332 – pLacZi/JRC0332 và pHISi/ JRC0528 – pLacZi/JRC0528. Các thể biến nạp lần lƣợt trên môi trƣờng khuyết dƣỡng SD/-Leu/-Ura/-His có 3-AT (Phụ lục 6, Bảng 3.1) để xác định sự biểu hiện của gen chỉ thị và bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc (Phụ lục 7, Bảng 3.1) để chọn ra các dịng cDNA có kích thƣớc lớn hơn 500 bp.