Ghi chú: Cây lúa non 3 lá non được trồng trong điều kiện không tưới nước liên tục 2 tuần (A) và 3 tuần (B), sau đó được tưới nước trở lại trong 3 ngày. (WT) cây lúa không chuyển
gen; (L1, L6, L7) dòng lúa T1 biểu hiện OsNLI-IF ở mức thấp; (L4, L8, L13) dòng lúa T1 biểu hiện OsNLI-IF ở mức trung bình; (L12, L14) dịng lúa T1 biểu hiện OsNLI-IF ở mức cao. Hình trái: minh hoạ vị trí sắp xếp các dịng lúa thí nghiệm; hình phải: ảnh chụp cây lúa sau 3 ngày tưới nước phục hồi.
Trong các công bố về nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn trƣớc đây, các tác giả sử dụng rất nhiều phƣơng pháp thí nghiệm khác nhau để đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây chuyển gen [34, 45, 51]. Tuy nhiên, đánh giá nhanh khả năng chống chịu hạn của cây dựa trên số lƣợng cây sống sót sau giai đoạn tiếp xúc với điều kiện stress hạn giả định ụng trong hầu hết các nghiên cứu. Cây chuyển gen đƣợc xử lý stress hạn bằng cách ngừng tƣới nƣớc một thời gian, sau đó tƣới nƣớc trở lại và so sánh khả năng phục
hồi sau giai đoạn stress hạn với cây đối chứng (không chuyển gen hoặc đƣợc chuyển cấu trúc khơng mang gen đích). Tran và nhóm nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp này để đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng A. thaliana đƣợc
chuyển cấu trúc 35S:ANAC019, 35S:ANAC055 và 35S:ANAC072 [113]. Tƣơng tự,
Liu và nhóm nghiên cứu đã chứng minh khả năng chống chịu hạn và lạnh của cây
A. thaliana biểu hiện gen DREB1A dựa trên số lƣợng cây chuyển gen phục hồi sau
stress [77]. Khả năng chống chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen DREB1 và
OsDREB1 cũng đƣợc chứng minh dựa trên tỉ lệ sống sót của cây lúa sau khi xử lý
stress trong nghiên cứu của Ito và nhóm nghiên cứu [85]. Bằng phƣơng pháp ngừng tƣới nƣớc để tạo ra môi trƣờng khô hạn giả định, các dòng lúa chuyển gen
Ubi:OsNLI-IF bƣớc đầu đã đƣợc chứng minh có dấu hiệu chống chịu hạn cao hơn
so với cây lúa không chuyển gen.
Bảng 3.11: Tỉ lệ cây lúa chuyển gen phục hồi sau xử lý hạn.
Tên dòng Tỉ lệ cây phục hồi *
Ngừng tƣới nƣớc 2 tuần Ngừng tƣới nƣớc 3 tuần
WT 0/5 0/5 L1 5/5 3/5 L4 4/5 - L6 5/5 - L7 5/5 - L8 5/5 - L12 3/5 - L13 4/5 0/5 L14 4/5 0/5
(WT) Dòng lúa khơng chuyển gen; (L1-14) Dịng lúa chuyển gen.
(*) Số cây phục hồi sau xử lý stress hạn trên tổng số cây kiểm tra; (-) Khơng tiến hành thí nghiệm.
Một điểm đáng chú ý trong nghiên cứu này là sự biểu hiện của OsNLI-IF
trong các dòng cây chuyển gen của chúng tơi có tƣơng quan với khả năng chống chịu stress. Trong tất cả các nghiên cứu trƣớc đây, sự biểu hiện của một nhân tố phiên mã đáp ứng stress sẽ làm tăng hoặc giảm khả năng chống chịu stress của cây chuyển gen. Tuy nhiên, cũng có một số nghiên cứu đã cho thấy mức độ biểu hiện
khác nhau của một nhân tố phiên mã có thể gây ra sự nhạy cảm với các yếu tố stress ở mức độ khác nhau, ví dụ nhƣ XERICO và ABR1 [62, 90]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh cây chuyển gen (lúa và thuốc lá) biểu hiện OsNLI-IF ở mức độ thấp có dấu hiệu chống chịu hạn cao hơn so với cây đối chứng (Hình 3.32 & Hình 3.36). Mặc dù vẫn cần có những nghiên cứu sâu hơn để hiểu đƣợc chính xác cơ chế điều hịa hoạt động gen của OsNLI-IF trong đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật, các kết quả nghiên cứu của chúng tôi bƣớc đầu đã xác định đƣợc protein này là một nhân tố hoạt hố phiên mã có tham gia vào q trình điều hồ khả năng chống chịu stress của thực vật theo con đƣờng không phụ thuộc ABA.
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu đƣợc trong q trình nghiên cứu, chúng tơi rút ra một số kết luận nhƣ sau:
1. Gen OsNLI-IF (mã số NM_001050330.1) đã đƣợc phân lập từ thƣ viện cDNA xử lý hạn và mặn của lúa và nhân dòng vào vector pGEM-T. Trình tự OsNLI-
IF phân lập đƣợc có kích thƣớc 1850 bp, mang vùng khơng mã hóa đầu 5’
dài 311 bp, vùng khơng mã hóa đầu 3’ dài 219 bp và vùng ORF dài 1.320 bp mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 439 acid amin.
2. Gen OsNLI-IF cảm ứng biểu hiện với các yếu tố môi trƣờng bất lợi bao gồm hạn, mặn, lạnh và nhiệt độ cao theo con đƣờng điều hịa khơng phụ thuộc ABA. OsNLI-IF là một nhân tố phiên mã có khả năng liên kết đặc hiệu với đoạn DNA chứa hai motif CCTCCTCC CTCCAC, hoạt hóa q trình phiên mã của gen đích và tƣơng tác với protein ubiquitin.
3. Trình tự gen OsNLI-IF đã đƣợc ghép nối vào các cấu trúc biểu hiện gen
trong tế bào thực vật, đặt dƣới sự điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục
35S Ubiquitin và promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9. Các
vector biểu hiện gen OsNLI-IF đã đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 để phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen thực vật.
4. Đã chuyển thành công cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào thuốc lá, cấu trúc Ubi:OsNLI-IF vào lúa và đã xác định đƣợc biểu hiện của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen T1. Các dòng thuốc lá và lúa chuyển gen T1 có tốc độ sinh trƣởng chậm hơn so với các dòng cây đối chứng trong điều kiện bình thƣờng. Trong thí nghiệm xử lý stress hạn (ngừng tƣới nƣớc), cây chuyển gen thể hiện khả năng chống chịu cao hơn rõ rệt so với cây đối chứng. Tỉ lệ cây thuốc lá chuyển gen sống sót đạt 22 – 75% so với 8 – 16% của cây đối chứng; tỉ lệ cây lúa chuyển gen sống sót đạt 60 – 100% so với 0% của cây đối chứng.
KIẾN NGHỊ
Dựa trên các kết luận rút ra từ kết quả nghiên cứu trên đây, chúng tôi đƣa ra một số hƣớng nghiên cứu tiếp theo nhƣ sau:
- Tiếp tục nghiên cứu cơ chế hoạt động và con đƣờng điều hòa hoạt động gen liên quan tới đáp ứng chống chịu stress của nhân tố phiên mã OsNLI-IF. - Tiếp tục nghiên cứu, phân tích các dịng cây chuyển gen OsNLI-IF ở các thế
hệ T2 , T3… để làm rõ của protein OsNLI-IF đối với đáp ứng chống chịu các yếu tố stress phi sinh học.
- Mở rộng nghiên cứu chuyển gen OsNLI-IF vào các đối tƣợng cây trồng khác với các promoter điều khiển hoạt động cảm ứng điều kiện stress để phục vụ công tác chọn tạo giống.
DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyễn Duy Phƣơng, Trần Tuấn Tú, Phạm Xuân Hội (2012), “Thiết kế thƣ viện ADNc chịu hạn ở lúa và phân lập gen NLI-IF1 bằng kỹ thuật sàng lọc phép lai đơn trong tế bào nấm men”, Tạp chí Sinh học, 34(1), tr. 114-122.
2. Nguyễn Duy Phƣơng, Narendra Tuteja, Lê Huy Hàm, Phạm Xuân Hội (2012),
“Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp NLI-IF từ tế bào Escherichia coli”, Tạp chí Sinh học, 34(3), tr. 347-353.
3. Nguyễn Duy Phƣơng, Narendra Tuteja, Phạm Xuân Hội (2013), “Thiết kế các hệ vector biểu hiện mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NLI-IF liên quan đến tính chịu hạn của lúa”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 29(1), tr. 36-44.
4. Nguyễn Duy Phƣơng, Narendra Tuteja, Phạm Xuân Hội (2013), “Nghiên cứu khả năng tƣơng tác in vivo của protein NLI-IF liên quan đến tính chống chịu
stress ở lúa”, Tạp chí Sinh học, 35(1), tr. 92-98.
5. Nguyễn Duy Phƣơng, Narendra Tuteja, Phạm Xuân Hội (2014), “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein NLI-IF liên quan đến tính chịu hạn vào cây thuốc lá”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nông thôn, 214, tr. 79-84.
6. Nguyen Duy Phuong, Narendra Tuteja, Phan Tuan Nghia, Pham Xuan Hoi (2015), “Identification and characterization of a stress inducible gene OsNLI-IF
enhancing drought tolerance in transgenic tobacco”, Current Science, 109(3),
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Phƣơng Dung và Phạm Xuân Hội (2010), “Phân lập và thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn OsNAC6”, Tạp chí
Nơng nghiệp và Phát triển Nông thôn, 156(1), tr. 7-13.
2. Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Nơng Văn Hải, Chu Hồng Hà (2008), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta (Melia azedarach L.) thông qua phôi soma từ thân mầm phục vụ chuyển gen”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(2), tr. 227-232.
3. Phạm Thị Thu Hằng (2011), Phân lập và thiết kế vector mang gen mã hoá nhân tố phiên mã OsNAC1 ở lúa, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
4. Phạm Xuân Hội và Nguyễn Duy Phƣơng (2012), “Khả năng liên kết đặc hiệu với trình tự DRE của nhân tố phiên mã OsDREB1A”, Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển
Nơng thơn, 190(1), tr. 27-32.
5. Huỳnh Thị Thu Huệ, Lê Thị Nguyên Bình, Nguyễn Thị Tình, Bùi Thị Tuyết, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Thị Nguyên Bình, Nguyễn Thị Tình, Bùi Thị Tuyết (2011), “Phân lập SUS1 Promoter từ cây ngô và thiết kế vector chuyển gien thực vật mang gen mã hóa Crya(C) dƣới sự điều khiển của SUS1 Promoter”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 9(3), tr. 341-347.
6. Nguyễn Thị Nhã, Nguyễn Thị Tâm, Trịnh Thị Vân Anh, Thái Thị Lệ Hằng, Trịnh Minh Hợp, Bùi Minh Trí, Lê Trọng Tình (2014), “Chuyển gien điều khiển chịu hạn
DREB2ACA vào cây bông (Gossypium hirsutum L.) thơng qua A. tumefaciens”, Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển Nông thôn, 244(1), tr. 3-12.
7. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú và Phạm Xuân Hội (2009), “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen điều khiển chịu hạn MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi thơng qua Agrobacterium”, Tạp chí Sinh học, 31(2), tr. 79-88.
8. Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Mạnh Cƣờng (2012), “Thiết kế vector mang gen OPHC2 phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu”, Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ, 90(2), tr. 59-64.
9. Phùng Hữu Thạnh, Nguyễn Thị Lang (2006), “Chuyển gen kháng bệnh trên cây lúa
Oryza sativa nhờ Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 21(1), tr. 11-15.
10. Trần Tuấn Tú, Cao Lệ Quyên, Lê Huy Hàm và Phạm Xuân Hội (2009), “Phân lập gen điều khiển OsRap2.4B liên quan đến tính chịu hạn ở lúa”, Tạp chí Khoa học &
Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 4(13), tr. 118-126.
11. http://db1.vista.gov.vn 12. http://kc04.vpct.gov.vn
Tiếng Anh
13. Aguado-Santacruz G.A. (2006), “Genetic manipulation of plants for increased drought tolerance”, Advances in Agricultural and Food Biotechnology, Research
Signpost, Kerala, India, pp. 71-98.
14. Ambawat S., Sharma P., Yadav N.R., Yadav R.C. (2013), “MYB transcription factor genes as regulators for plant responses: an overview”, Physiol. Mol. Biol. Plants.,
19(3), pp. 307-321.
15. Amero S.A., James T.C., Elgin S.C. (1988), “Production of antibodies using protein in gel bands”, Methods Mol. Biol., 3, pp. 355-362.
16. Anjum S.A, Xie X.Y., Wang L.C, Saleem M.F., Man C., Lei W. (2011), “Morphological, physiological and biochemical responses of plants to drought stress”, Afr. J. Agric. Res., 6(9), pp. 2026-2032.
17. Araus J.L., Slafer G.A., Reynolds M.P., Royo C. (2002), “Plant breeding and drought in C3 cereals: what should we breed for?”, Ann. Bot., 89, pp. 925-940.
18. Beatriz X.C., Francisco A.R.O., Leonardo F.E., Roberto R.M. (2011), “Drought tolerance in crop plants”, Am. J. Plant Physiol., 5(5), pp. 241-256.
19. Bhat S.R., Srinivasan S. (2002), “Molecular and genetic analyses of transgenic plants: Considerations and approaches”, Plant Sci., 163(4), pp. 673-681.
20. Bohnert H.L., Jesen R.G. (1996), “Strategies of engineering water stress tolerance in plants”, Tibtech., 14(3), pp. 89-97.
21. Borsani O., Zhu J., Verslues P.E., Sunkar R., Zhu J.K. (2005), “Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis”, Cell, 123(7), pp. 1279-1291.
22. Bourgouin C., Lundgren S.E., Thomas J.B. (1992), “Apterous is a Drosophila LIM domain gene required for the development of a subset of embryonic muscles”,
Neuron, 9(3), pp. 549-561.
23. Charu L., Amita Y., Manoj P. (2011), “Role of plant transcription factors in abiotic stress tolerance, abiotic stress response in plants”, Abiotic stress response in plants -
24. Chen H., Lin Y.J., Zhang Q.F. (2011), “Review and prospect of transgenic rice research”, Chinese Sci. Bull., 54(22), pp. 4049-4068
25. Chen L., Song Y., Li S., Zhang L., Zou C., Yu D. (2012), “The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses”, Biochim. Biophys. Acta., 1819(2), pp. 120-128. 26. Christensen A.H., Sharrock R.A., Quail P.H. (1992), “Maize polyubiquitin genes:
structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation”, Plant Mol. Biol., 18(4),
pp. 675-689.
27. Clontech, Yeast Protocols Handbook, www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttach- ment.jsp?cItemId=17602.
28. Cominelli E., Tonelli C. (2010), “Transgenic crops coping with water scarcity”, N. Biotechnol., 27(5), pp. 473-477.
29. Cornejo M.J., Luth D., Blankenship K.M., Anderson O.D., Blechl A.E. (1993) “Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice”, Plant Mol. Biol., 23(3),
pp. 567-581.
30. Covarrubias A.A., Reyes J.L. (2010) “Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs”, Plant Cell Environ., 33(4), pp. 481-489. 31. Dahan J., Koen E., Dutartre A., Lamotte O., Bourque S. (2011), “Post-translational
modifications of nuclear proteins in the response of plant cells to abiotic stresses”,
Abiotic Stress Response in Plants – Physiol., Biochem. Genet. Persp., InTech, DOI:
10.5772/23822.
32. Day C.D., Lee E., Kobayashi J., Holappa L.D., Albert H., Ow D.W. (2000), “Transgene integration into the same chromosome location can produce alleles that express at a predictable level, or alleles that are differentially silenced”, Gen. Dev.,
14(22), pp. 2869-2880.
33. Ding D., Zhang L., Wang H., Liu Z., Zhang Z., Zheng Y. (2009) “Differential expression of miRNAs in response to salt stress in maize roots”, Ann. Bot., 103(1),
pp. 29-38.
34. Dong C.J., Liu J.Y., (2010), “The Arabidopsis EAR-motif-containing protein
RAP2.1 functions as an active transcriptional repressor to keep stress responses under tight control”, BMC Plant Biol., 10(1), pp. 47, DOI: 10.1186/1471-2229-10-47. 35. Dubos C., Stracke R., Grotewold E., Weisshaar B., Martin C., Lepiniec L. (2010),
“MYB transcription factors in Arabidopsis”, Trends Plant Sci., 15(10), pp. 573-581. 36. Dubouzet J.G., Sakuma Y., Ito Y., Kasuga M., Dubouzet E.G., Miura S., Seki M.,
Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2003), “OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold- responsive gene expression”, Plant J., 33(4), pp. 751-763.
37. Eulgem T., Rushton P.J., Robatzek S., Somssich I.E. (2000), “The WRKY superfamily of plant transcription factors”, Trends Plant Sci., 5(5), pp. 199-206. 38. Farooq M., Wahid A., Kobayashi N., Fujita D., Basra S.M.A. (2009), “Plant
drought stress: effects, mechanisms and management”, Agron. Sustain. Dev., 29(1), pp. 185-212.
39. Floris M., Mahgoub H., Lanet E., Robaglia C., Menand B. (2009), “Post- transcriptional regulation of gene expression in plants during abiotic stress”, Int. J. Mol. Sci., 10(7), pp. 3168-3185.
40. Frey N.F., Muller P., Jammes F., Kizis D., Leung J., Perrot-Rechenmann C., Bianchi M.W. (2010), “The RNA binding protein Tudor-SN is essential for stress tolerance and stabilizes levels of stress-responsive mRNAs encoding secreted proteins in
Arabidopsis”, Plant Cell, 22(5), pp. 1575-1591.
41. Gao J.P., Chao D.Y., Lin H.X. (2008), “Toward understanding molecular mechanisms of abiotic stress responses in rice”, Rice, 1(1), pp. 36-51.
42. Gupta P., Raghuvanshi S., Tyagi A.K. (2001) “Assessment of the efficiency of various gene promoters via biolistics in leaf and regenerating seed callus of millets, Eleusine coracana and Echinochloa crus-galli”, Plant Biotechnol., 18(4), pp. 275-282.
43. Hou K.C., Zaniewski R., Roy S. (1991), “Protein A immobilized affinity cartridge for immunoglobulin purification”, Biotechnol. Appl. Biochem., 13(2), pp. 257-268. 44. Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., Xiong L. (2006), “Overexpressing a
NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(55), pp. 12987-12992.
45. Hu H., You J., Fang Y., Zhu X., Qi Z., Xiong L. (2008) “Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice”, Plant Mol. Biol., 67(1-2), pp. 169-181.
46. Hull R., Covey S.N., Dale P. (2000), “Genetically modified plants and the 35S
promoter: assessing the risks and enhancing the debate”, Microb. Ecol. Health Dis.,
12(1), pp. 1-5.
47. Hur Y. and Kim D. (2014), “Overexpression of OsMAPK2 enhances low phosphate tolerance in rice and Arabidopsis thaliana”, Am. J. Plant Sci., 5(4), pp. 452-462.