Ghi chú: Sản phẩm PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv được điện di trên gel
agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1 – 5: khn là thư viện cDNA pha lỗng tỉ lệ 1:1, 1:10, 1:50, 1:100 và 1:500; giếng 6: đối chứng âm (khơng có DNA khn).
Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc nhân bản bằng PCR. Kết quả ảnh điện di sản
phẩm PCR cho thấy tất cả PCR sử dụng khuôn là thƣ viện cDNA đều ch 1 băng DNA duy nhất có kích thƣớc khoảng 1,3 kb (Hình 3.4, giếng 1-5) tƣơng ứng với kích thƣớc theo lý thuyết của gen OsNLI-IF; trong khi phản ứng đối chứng âm khơng có DNA khn, chúng tơi khơng thu đƣợc băng DNA này (Hình 3.4, giếng 6).
Nhƣ vậy, với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế, đoạn DNA mã hóa protein OsNLI- IF đã đƣợc khuếch đại thành công từ thƣ viện cDNA xử lý hạn và mặn của lúa. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch để sử dụng cho thí nghiệm nhân dịng gen tiếp theo.
3.1.3.2. Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T
Sản phẩm nhân bản đoạn gen OsNLI-IF đƣợc tinh sạch (nhằm loại bỏ toàn bộ các thành phần dƣ thừa của PCR và các băng DNA không đặc hiệu khác), sau đó ghép nối vào vector nhân dòng pGEM-T (Phụ lục 1). Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc khuếch đại bằng PCR sử dụng Taq DNA polymerase nên sản phẩm PCR sau khi
đƣợc tinh sạch là các đoạn DNA có A nhân
dịng trực tiếp vào vector nhân dịng mạch thẳng có đầu T (pGEM-T).
Thể biến nạp (khuẩn lạc trắng) xuất hiện trên mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung chất kháng sinh Ampicillin, chất cảm ứ ất X-Gal đƣợc sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF.
Một khuẩn lạc trắng có kết quả PCR dƣơng tính sau đó đƣợc chọn ngẫu nhiên để ni cấy và tách chiết DNA plasmid và kiểm tra bằng hai phƣơng pháp PCR và cắt enzyme giới hạn. Các sản phẩm PCR và cắt giới hạn khi đƣợc điện di trên gel agarose 1% đã cho chính xác băng DNA đúng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết của OsNLI-IF (Hình 3.5A, giếng 1 và 3; Hình 3.5B, giếng 1) chứng tỏ plasmid thu đƣợc là vector tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF.
Hình 3.5: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR plasmid
tái tổ hợp; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi T7-Pro/SP6-Pro; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/OsNLI-IF; giếng 2 và 4: đối chứng âm (khơng có DNA khn). (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng NdeI ; giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
3.1.3.3. Giải trình tự gen OsNLI-IF
Để khẳng định chính xác đoạn DNA đƣợc nhân bả
- -IF, chúng tơi tiến hành giải trình
tự vector tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF và phân tích kết quả bằng phần mềm BioEdit (Hình 3.6). Kết quả so sánh trình tự nucleotide cho thấy đoạn DNA đã nhân dịng có kích thƣớc 1320 bp, mang trình tự mã hóa một chuỗi polypeptide gồm 439 acid amin (Phụ lục 9), tƣơng đồng với trình tự DNA có mã số NM_001050330.1 trong GenBank và đƣợc đặt tên là OsNLI-IF. Các kết quả thu đƣợc chứng tỏ khung đọc
Hình 3.6: Trình tự OsNLI-IF trong vector tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF
Ghi chú: (A) Một phần kết quả giải trình tự với mồi T7-Pro. (B) Một phần kết quả giải
trình tự với mồi SP6-Pro.
Trong các nghiên cứu về biểu hiện và chức năng của gen đã công bố trƣớc đây, gen quan tâm thƣờng đƣợ
biểu hiện nhằm phục vụ việc nghiên cứu chức năng protein [51, 95, 109, 113]. Hầu hết các tác giả đều sử dụng kỹ thuật PCR hoặc RT-PCR để nhân bản đoạn DNA mong muốn mang trình tựu đầy đủ (cả vùng khơng mã hóa 5’-UTD, 3’-UTD và vùng mã hóa ORF) hoặc chỉ mang chính xác trình tự khung đọc mở của gen quan tâm [50, 51]. Ở nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng hai mồi đặc hiệu để nhân bản chính xác trình tự khung đọc mở của gen OsNLI-IF từ thƣ viện cDNA của lúa và dịng hóa vào vector pGEM-T. Sản phẩm nhân dòng là nguồn nguyên liệu cho tồn bộ các thí nghiệm nghiên cứu hoạt động chức năng của gen OsNLI-IF tiếp theo. 3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN OsNLI-IF
3.2.1. Biểu hiện của gen OsNLI-IF trong các điều kiện stress phi sinh học
Dựa trên kết quả thí nghiệm sàng lọc gen bằng kỹ thuật Y1H, protein OsNLI-IF đƣợc dự đốn có khả năng tƣơng tác với trình tự đích nằm trong vùng promoter của hai gen JRC0332 và JRC0528 đƣợc hoạt hóa biểu hiện bởi yếu tố stress lạnh, mặn và hormone ABA [96]. Để xác định mơ hình biểu hiện của gen
OsNLI-IF trong các điều kiện stress phi sinh học, cây lúa non ba tuần tuổi xử lý với
ngâm rễ trong dung dịch PEG 20% (hạn) và NaCl 200 mM (mặn), giữ trong điều kiện nhiệt độ 4oC (lạnh) và 42oC (nhiệt độ cao), ngâm trong dung dịch ABA 100 µM (đáp ứng hormone). RNA tổng số của các mẫu lúa đã xử lý stress trong khoảng thời gian khác nhau đƣợc tách chiết và sử dụng cho các thí nghiệm phân tích hàm lƣợng mRNA của gen OsNLI-IF bằng kỹ thuật Real-time PCR. Mẫu RNA tách chiết từ cây lúa ở thời điểm chƣa xử lý stress đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng âm. Trong thí nghiệm này, gen actin đƣợc sử dụng làm gen nội chuẩn để so sánh tƣơng quan giữa các mẫu phân tích (Hình 3.7).
Kết quả phân tích hàm lƣợng mRNA bằng Real-time PCR cho thấy gen
OsNLI-IF hầu nhƣ khơng có sự thay đổi mức đổi biểu hiện trong mô thân và lá trong
suốt giai đoạn xử lý cây với các điều kiện stress giả định khác nhau (Hình 3.7). Ngƣợc lại, trong mơ rễ, số lƣợng bản sao mRNA của OsNLI-IF thay đổi rõ rệt theo
thời gian trong thí nghiệm xử lý stress. Mức độ biểu hiện cao nhất của OsNLI-IF
quan sát đƣợc ở thời điểm 12 giờ trong thí nghiệm xử lý stress mặn, thể hiện ở hàm lƣợng mRNA tăng khoảng 68 lần so với bình thƣờng. Hàm lƣợng mRNA của OsNLI-
IF tăng đáng kể trong vòng 2 giờ sau khi tiếp xúc với stress lạnh và mặn (tăng khoảng
20 lần), đạt đỉnh sau 6 – 12 giờ xử lý stress. Trong thí nghiệm xử lý điều kiện mất nƣớc, mức độ phiên mã của OsNLI-IF tăng chậm hơn nhƣng đạt đỉnh khá sớm ở thời điểm 2 giờ (tăng ~30 lần), sau đó bắt đầu giảm dần. Đối với thí nghiệm xử nhiệt độ 42oC, chúng tôi phát hiện hàm lƣợng mRNA của OsNLI-IF thay đổi rất nhanh, tăng hơn 40 lần chỉ trong thời gian 30 phút, sau đó bắt đầu giảm dần. Tuy nhiên, đến thời điểm 6 giờ sau khi xử lý stress, OsNLI-IF dƣờng nhƣ tăng biểu hiện trở lại và đạt gần tới mức biểu hiện cao nhất (thời điểm 0,5 giờ) sau 12 giờ. Mức độ tích lũy mRNA của OsNLI-IF trong điều kiện hạn và lạnh xảy ra chậm hơn so với trong điều kiện stress nhiệt độ cao và đều đạt đỉnh ở thời điểm 6 giờ sau khi xử lý stress. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của OsNLI-IF trong điều kiện stress hạn giảm rất nhanh về gần mức cơ bản sau 12 giờ xử lý stress. Ngƣợc lại, trong các thí nghiệm xử lý stress lạnh, mất nƣớc và đặc biệt là stress mặn, OsNLI-IF vẫn duy trì mức độ biểu hiện cao sau 24 giờ tiếp xúc với yếu tố stress. Đối với thí nghiệm xử lý cây lúa non bằng hormone ABA,
chúng tôi không phát hiện đƣợc sự thay đổi đáng kể nào về hàm lƣợng mRNA trong hầu hết thời gian thí nghiệm. Các kết quả thu đƣợc này chứng tỏ quá trình phiên mã của OsNLI-IF đƣợc điều hòa bởi nhiều yếu tố stress phi sinh học khác nhau, bao gồm stress mặn, hạn, mất nƣớc, lạnh và nhiệt độ cao.
.
Hình 3.7: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện môi trƣờng bất lợi
Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen OsNLI-IF trong cây lúa đã xử lý stress để khơ trong khơng
khí (mất nước), hạn (PEG 20%), mặn (NaCl 200 mM), lạnh (4oC), nóng (42oC) và hormone (ABA 100 µM) trong thời gian 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ được xác định bằng Real-time PCR, sử dụng khuôn là RNA tách chiết từ mô thân/lá (cột màu đỏ) và mơ rễ (cột màu tím). Mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử lý stress (0 h) có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm.
Trong hơn hai thập kỉ qua, đã có rất nhiều nghiên cứu chi tiết về mơ hình biểu hiện của các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu
yếu tố stress phi sinh học ở thực vật đã đƣợc thực hiện. Kết quả thu đƣợc từ các nghiên cứu đã cho thấy mơ hình biểu hiện của các gen này rất đa dạng và không phụ thuộc vào loài thực vật hay cấu trúc cũng nhƣ chức năng của sản phẩm protein [14, 93]. Nhiều nhân tố phiên mã đƣợc xếp vào cùng một họ và một nhóm dựa theo sự tƣơng đồng về cấu trúc nhƣng đáp ứng với các yếu tố stress khác nhau trong các đối tƣợng thực vật khác nhau [82]; ví dụ nhƣ ZmDBF1 (ngô) biểu hiện đáp ứng với stress mất nƣớc và mặn [61], AhDREB1 (Atriplex hortensis) tham gia vào con đƣờng đáp ứng hạn và mặn [104], GmDREBb (đậu tƣơng) phiên mã mạnh trong
điều kiện stress lạnh, hạn và mặn [72], AtRap2.4 (A. thaliana) đƣợc tăng cƣờng biểu hiện bởi yếu tố stress hạn và mặn, nhƣng giảm trong điều kiện stress ánh sáng [73]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra sự biểu hiện của gen OsNLI-IF ở
lúa đƣợc tăng cƣờng bởi hầu hết tất cả yếu tố stress phi sinh học, bao gồm cả mặn, hạn, mất nƣớc, lạnh và nhiệt độ cao (Hình 3.7), chứng tỏ OsNLI-IF có thể là một protein có nhiều chức năng quan trọng tham gia vào hệ thống đáp ứng điều kiện ngoại cảnh bất lợi của tế bào thực vật, trong đó có điều kiện khô hạn.
Bên cạnh đặc điểm biểu hiện cảm ứng điều kiện stress, nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã điều hịa biểu hiện của các gen đáp ứng điều kiện stress còn biểu hiện đặc hiệu mô và biểu hiện tƣơng quan với thời gian tiếp xúc yếu tố stress.
AhDREB1 đƣợc điều hòa bởi yếu tố stress mặn nhƣng chỉ biểu hiện ở mô rễ; OsDREB1F đƣợc biểu hiện liên tục trong hầu hết các mô và cơ quan khác nhau
nhƣ lá non, rễ non, lá trƣởng thành, rễ trƣởng thành và mô sẹo; GmDREBa và GmDREBb cũng đƣợc biểu hiện trong lá cây đậu tƣơng dƣới điều kiện hạn, mặn
và lạnh, trong khi GmDREBc chỉ biểu hiện ở rễ trong điều kiện hạn, mặn và ABA [23]. Dựa trên kết quả phân tích bằng Real-time PCR (Hình 3.7), gen OsNLI-IF
bƣớc đầu đƣợc xác định biểu hiện đặc hiệu trong mô rễ của cây lúa non dƣới các điều kiện stress phi sinh học liên quan tới áp suất thẩm thấu và nhiệt độ.
Nhiều tác giả khi nghiên cứu về cơ chế chống chịu yếu tố stress phi sinh học của thực vật đã đƣa ra kết luận trong tế bào tồn tại ít nhất hai con đƣờng điều hoà hoạt động gen cơ bản đáp ứng với yếu tố stress: (i) con đƣờng điều hoà phụ
thuộc ABA và (ii) con đƣờng điều hịa khơng phụ thuộc ABA [74, 82]. Sự biểu hiện của đa số các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu yếu tố stress phi sinh học thuộc họ bZIP và MYB đƣợc điều hòa theo con đƣờng phụ thuộc tín hiệu ABA, trong khi nhiều gen thuộc phân họ DREB đã đƣợc chứng minh cảm ứng biểu hiện theo con đƣờng điều hịa khơng phụ thuộc tín hiệu ABA [52]. Ngoài ra, các thành viên của một số họ gen khác nhƣ NAC, WRKY và ZF
đƣợc xác định có liên quan tới cả hai con đƣờng điều hịa hoạt động gen phụ thuộc và khơng phụ thuộc tín hiệu ABA [74]. Bằng kỹ thuật Real-time PCR chúng tôi đã chứng minh OsNLI-IF đƣợc cảm ứng biểu hiện bởi nhiều yếu tố stress phi sinh
học khác nhau theo con đƣờng khơng phụ thuộc vào tín hiệu ABA (Hình 3.7).
3.2.2. Hoạt tính liên kết đặc hiệu với đoạn DNA đích của protein OsNLI-IF
Một protein đóng vai trị là một nhân tố phiên mã trong tế bào phải có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hay một vài trình tự DNA nhất định. Trong thí nghiệm sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA, gen OsNLI-IF đã đƣợc phân lập trong cả
hai thí nghiệm sàng lọc gen sử dụng hai đoạn DNA đích khác nhau (JRC0332 và JRC0528) có kích thƣớc 50 bp mang hai motif CCTCCTCC và CTCCAC; kết quả này cho thấy protein OsNLI-IF có thể nhận biết đƣợc đồng thời cả hai đoạn DNA đích này. Để chứng minh cho giả thuyết này, chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật Y1H, trong đó trình tự DNA mã hố protein OsNLI-IF đƣợc ghép nối với trình tự mã hố domain hoạt hố phiên mã AD-GAL4 trên vector biểu hiện pAD-GAL4 để biểu hiện protein dung hợp trong tế bào nấm men. Khi đó, OsNLI-IF sẽ đóng vai trị là domain (vùng chức năng) liên kết DNA để tƣơng tác với promoter của hai gen
HIS3 và lacZ trên vector chỉ thị pHISi và pLacZi và hoạt hố q trình phiên mã.
3.2.2.1. Ghép nối đoạn gen OsNLI-IF vào vector pAD-GAL4
Đoạn gen OsNLI-IF trên vector pGEM/OsNLI-IF đƣợc ghép nối vào vị trí nhận biết của EcoRI/XhoI trên vector pAD-GAL4 (Phụ lục 1). Hai đoạn DNA kích thƣớc 1,3 kb (tƣơng ứng với đoạn gen OsNLI-IF) và 7,7 kb (tƣơng ứng với vector
pAD-GAL4 mạch thẳng) thu đƣợc từ sản phẩm cắt giới hạn vector pGEM/OsNLI- IF và pAD-GAL4 đƣợc tinh sạch, ghép nối và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
Các thể biến nạp xuất hiện trên môi trƣờng chọn lọc sàng lọc bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu của gen đích. Kết quả thu đƣợc cho thấy một số khuẩn lạc có mang đoạn gen OsNLI-IF, sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc này khi
đƣợc điện di trên gel agarose 1% cho 1 băng DNA duy nhất có kích thƣớc 1,3 kb (Hình 3.8B, giếng 1, 3 và 4) tƣơng tự nhƣ phản ứng đối chứng dƣơng sử dụng vector pGEM/OsNLI-IF làm khuôn (Hình 3.8B, giếng 7).
Hình 3.8: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pAD-GAL4
Ghi chú: (A) Cắt giới hạn pGEM/OsNLI-IF và pAD-GAL4 bằng EcoRI/XhoI và điện di
sản phẩm trên gel agarose 1%; giếng 1 và 2: pAD-GAL4; giếng 3 và 4: pGEM/OsNLI- IF; giếng 1 và 3: vector nguyên bản; giếng 2 và 4: sản phẩm cắt giới hạn. (B) Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1 – 5: khuôn là các khuẩn lạc từ 1 – 5; giếng 6: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 7: đối chứng dương (khuôn là pGEM/OsNLI-IF). Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Thể biến nạp có kết quả PCR dƣơng tính đƣợc ni cấy, tách chiết plasmid và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích trong plasmid tái tổ hợp bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới hạn. Đối với PCR kiểm tra plasmid tinh chiết bằng cặp mồi EcoRI- NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv đặc hiệu cho OsNLI-IF và cặp mồi đặc hiệu AD-Fw/AD-Rv cho vector pAD-GAL4, sản phẩm PCR khi đƣợc điện di trên gel agarose cho 2 băng DNA có kích thƣớc lần lƣợt là 1,3 và 1,5 kb (Hình 3.9A, giếng 1 và 3). Khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI/XhoI, kết quả điện di cho 2 băng
DNA có kích thƣớc 1,3 và 7,7 kb (Hình 3.9B, giếng 1). Kích thƣớc của các băng DNA thu đƣợc này hồn tồn phù hợp với kích thƣớc theo tính tốn lý thuyết, chứng tỏ chúng tơi đã thu đƣợc plasmid tái tổ hợp pAD-GAL4 có mang khung đọc mở của gen OsNLI-IF (pAD/OsNLI-IF).
Hình 3.9: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pAD/OsNLI-IF
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
plasmid tái tổ hợp; giếng 1 và 3: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2 và 4: PCR với cặp mồi AD-Fw/AD-Rv; giếng 1 và 2: khuôn là pAD/OsNLI-IF; giếng 3 và