Dịng cây
Số cây kiểm tra
Tỉ lệ cây có kết quả PCR dƣơng tính
Mồi Actin Mồi Hygromycin Mồi GUS Mồi OsNLI-IF
TL1 20 20/20 18/20 18/20 18/20 TL3 20 20/20 15/20 15/20 15/20 TL4 20 20/20 20/20 20/20 20/20 TL7 20 20/20 17/20 17/20 17/20 TL8 20 20/20 12/20 12/20 12/20 TL10 20 20/20 18/20 18/20 18/20 ĐC2 10 10/10 8/10 8/10 0/10 ĐC3 10 10/10 6/10 6/10 0/10 ĐC8 10 10/10 8/10 8/10 0/10 ĐC9 10 10/10 10/10 10/10 0/10
TL: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF. ĐC: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301.
3.4.2.4. Phân tích mức độ biểu hiện OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá T1
Cấu trúc biểu hiện gen đích OsNLI-IF mặc dù đã đƣợc xác định có mặt trong cây chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR nhƣng protein quan tâm có đƣợc biểu hiện trong cây chuyển gen hay không phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, ví dụ nhƣ vị trí chèn cấu trúc biểu hiện gen đích, số bản sao của gen đích trong hệ gen cây chủ… [19]. Chính vì vậy, thí nghiệm phân tích mức độ biểu hiện của OsNLI-IF trong cây chuyển gen đã đƣợc tiến hành trên cơ sở xác định mức độ tích luỹ protein OsNLI-IF
trong mơ bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể đa dòng kháng đặc hiệu protein tái tổ hợp OsNLI-IF.
Để tạo kháng thể kháng protein OsNLI-IF, chúng tôi đã gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch bằng protein OsNLI-IF tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli. Protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện tối ƣu trong điều kiện nuôi cấy vi khuẩn ở 20oC với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,1 mM trong thời gian 5 (Phụ lục 15), sau đó đƣợc tinh sạch bằng hệ thống cột sắc ký ái lực Ni-NTA. Kết quả SDS-PAGE và lai thẩm tách miễn dịch (sử dụng kháng thể anti – His-tag) cho thấy protein tái tổ hợp đã đƣợc thu lại ở dạng tinh sạch và có kích thƣớc 52 kDa tƣơng ứng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết của protein dung hợp OsNLI-IF (Hình 3.28A & B). Protein dung hợp đƣợc chúng tôi xử lý với Thrombin để loại đuôi His- tag (Phụ lục 16) và sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên chuột.
Hình 3.28: Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA
Ghi chú: (A) Dịch chiết tế bào và các phân đoạn tinh sạch protein được điện di trên gel SDS-
PAGE 12%. (B) Protein OsNLI-IF tái tổ hợp được phát hiện bằng kháng thể anti – His-tag
pha loãng 1:50.000. Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1: pha cặn dịch chiết tế bào; giếng 2: pha lỏng dịch chiết tế bào; giếng 3: dịch không gắn cột; giếng 4: phân đoạn rửa cột cuối bằng imidazol 30 mM; giếng 5 – 10: các phân đoạn rửa giải bằng imidazol 250 mM.
Băng protein 52 kDa trên bản điện di mẫu protein OsNLI-IF tinh sạch đƣợc cắt ra và nghiền trong tá dƣợc để gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch. Kháng thể IgG đƣợc tinh sạch từ kháng huyết thanh sau ba tuần gây đáp ứng miễn dịch đã đƣợc kiểm tra khả năng nhận biết protein tái tổ hợp OsNLI-IF (Phụ lục 17) bằng cột sắc ký Protein A - Sepharose. Kết quả điện di mẫu kháng thể tinh sạch cho thấy
xuất hiện 2 băng protein có kích thƣớc khoảng 25 và 53 kDa (Hình 3.29A, giếng 2) tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của chuỗi nhẹ và chuỗi nặng của IgG. Trong thí nghiệm lai thẩm tách miễn dịch, kháng thể tinh sạch có khả năng nhận biết đặc hiệu mẫu protein OsNLI-IF đã tinh sạch cũng nhƣ protein OsNLI-IF có trong dịch chiết tế bào E. coli, cho chính xác băng protein 52 kDa (Hình 3.29B, giếng 1 và 2). Kết quả này chứng tỏ kháng thể IgG kháng đặc hiệu protein OsNLI-IF đã đƣợc tinh sạch thành công từ huyết thanh chuột bằng cột sắc ký Protein A - Sepharose.
Hình 3.29: Kiểm tra kháng thể IgG tinh sạch
Ghi chú: (A) Kháng thể tinh sạch qua cột sắc ký Protein A - Sepharose được điện di trên
gel SDS-PAGE 12%; giếng 1: phân đoạn rửa giải bằng đệm glycine-HCl; giếng 2: phân đoạn rửa cột cuối. (B) Protein OsNLI-IF tái tổ hợp được phát hiện bằng kháng thể IgG
tinh sạch pha loãng 1:10.000; giếng 1: dịch chiết tế bào E. coli; giếng 2: OsNLI-IF tái tổ hợp tinh sạch. Giếng M: thang chuẩn protein.
Sự có mặt của protein OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá chuyển gen T1 đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch với kháng thể kháng OsNLI-IF đã tạo đƣợc ở thí nghiệm trên. Các mẫu cây thuốc lá chuyển gen T1 35S:OsNLI-IF (dòng TL1, TL3, TL4, TL7, TL8 và TL10) kháng Hygromycin đƣợc nghiền trong đệm PBS và pha loãng về cùng một chỉ số OD280 để chuẩn hóa lƣợng protein tổng số và sử dụng cho thí nghiệm lai thẩm tách miễn dịch. Trong thí nghiệm này, mẫu cây thuốc lá T1 đƣợc chuyển cấu trúc khơng mang gen đích pCAMBIA1301 (dịng ĐC2) và mẫu cây thuốc lá không chuyển gen đƣợc phân tích đồng thời nhƣ những mẫu đối chứng âm; mẫu protein OsNLI-IF tái tổ hợp tinh sạch đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng.
Hình 3.30: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các dịng thuốc lá chuyển gen T1
Ghi chú: (A) Protein OsNLI-IF trong dịch chiết protein tổng số của các dòng thuốc lá
được phát hiện bằng kháng thể đa dòng đặc hiệu (pha loãng 1:2000); giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1 – 3 và 5 – 7: dòng TL1, TL3, TL4, TL7, TL8, TL10; giếng 4: OsNLI-IF tái tổ hợp (P); giếng 8: dòng ĐC8 (V); giếng 9: cây thuốc lá không chuyển gen (WT). (B) Đồ thị so sánh hàm lượng protein OsNLI-IF tương quan giữa các dòng thuốc lá; hàm lượng OsNLI-IF của dịng TL10 có giá trị bằng 1; giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm trên 3 cây khác nhau.
Kết quả lai thẩm tách miễn dịch cho thấy có 5 trong số 6 dòng thuốc lá chuyển gen đƣợc kiểm tra (TL1, TL3, TL7, TL8 và TL10) có biểu hiệ
sự 1 băng protein 52 kDa (Hình 3.30A, giếng 1, 2, 5, 6, và 7) tƣơng tự mẫu đối chứng dƣơng sử dụng protein OsNLI-IF tái tổ hợp (Hình 3.30A, giếng 4). Ngƣợc lại, cả 3 cây T1 thuộc dòng TL4 và 3 cây thuộc hai dòng đối chứng (chuyển cấu trúc pCAMBIA1301 và không chuyển gen) đều cho kết quả âm tính. Sử dụng phần mềm ImageJ, mức độ biểu hiện protein OsNLI-IF tƣơng quan giữa các dịng thuốc lá chuyển gen đã đƣợc xác định (Hình 3.30B). Kết quả so sánh cho thấy mức độ biểu hiện của gen đích OsNLI-IF có sự khác biệt đáng kể giữa các dòng thuốc lá chuyển gen. Cụ thể, hàm lƣợng protein OsNLI-IF cao nhất đƣợc phát hiện trong các cây thuộc hai dòng TL1 và TL8; hai dòng TL3 và TL7 có mức độ biểu hiện protein đích ở mức vừa phải; dịng TL10 có mức độ tích lũy OsNLI-IF thấp nhất; dòng TL4 hồn tồn khơng biểu hiện protein đích. Nhƣ vậy, bằng phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens, chúng tôi đã
chuyển thành công cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào cây thuốc lá và thu đƣợc các dòng thuốc lá chuyển gen T1 có biểu hiện protein đích OsNLI-IF.
Các nghiên cứu chuyển gen thực vật nói chung và nghiên cứu gen mã hoá nhân tố phiên mã nói riêng đƣợc thực hiện trƣớc đây thƣờng sử dụng phƣơng pháp phân tích biểu hiện của gen đích ở mức độ mRNA, sau đó là phân tích sự biểu hiện tính trạng liên quan tới gen chuyển [44, 73, 86, 112, 113]. Một vài nghiên cứu cũng đã sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện sự biểu hiện của protein đích bằng phƣơng pháp dựa trên liên kết kháng nguyên-kháng thể. Ví dụ, Liu và nhóm nghiên cứu đã xác định sự biểu hiện của gen TiMYB2R-1 trong cây lúa mì chuyển gen bằng cả hai phƣơng pháp RT-PCR và lai thẩm tách miễn dịch [78]. Trong nghiên cứu của Wang và nhóm nghiên cứu, mức độ tích luỹ protein TaWRKY10 (lúa mì) trong các dịng thuốc lá chuyển gen đã đƣợc chứng minh bằng phƣơng pháp lai thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đa dòng đặc hiệu [118]. Để phát hiện sự biểu hiện của nhân tố phiên mã RAP2.1 trong cây A. thaliana chuyển gen, Dong và nhóm nghiên cứu đã thiết kế vector biểu hiện protein dung hợp MYC:RAP2.1 và sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng protein MYC [34]. Trong nghiên cứu này, bằng phƣơng pháp lai thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đa dòng kháng đặc hiệu protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, chúng tôi đã xác định đƣợc sự tích luỹ protein đích OsNLI-IF trong các dịng thuốc lá chuyển gen với mức độ khác nhau. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Day và nhóm nghiên cứu trƣớc đây [32], trong đó các tác giả đã chứng minh vị trí của cấu trúc biểu hiện gen đích trên NST gây ảnh hƣởng đáng kể tới mức độ biểu hiện gen đích, dẫn tới sự tích luỹ protein đích khơng giống nhau giữa các dòng cây chuyển gen khác nhau.
3.4.2.5. Đánh giá khả năng sinh trưởng và chịu hạn của các dòng thuốc lá T1
Để xác định ảnh hƣởng của sự biểu hiện liên tục gen mã hóa OsNLI-IF đối với khả năng sinh trƣởng của cây thuốc lá chuyển gen, hạt của 3 dòng thuốc lá đại diện cho 3 mức độ biểu hiện gen khác nhau (TL1 – biểu hiện cao, TL10 – biểu hiện thấp và TL4 – không biểu hiện) đã đƣợc lựa chọn để tiếp tục phân tích, đánh giá kiểu hình. Hạt thuốc lá đƣợc cho nảy mầm trên mơi trƣờng MS có Hygromycin, sau đó đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR và lai thẩm tách miễn dịch để khẳng định sự có mặt và biểu hiện của gen đích. Các cây thuốc lá có kết quả kiểm tra dƣơng
tính đƣợc chuyển sang trồng trong chậu đất và theo dõi sinh trƣởng. Dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc pCAMBIA1301 (dòng ĐC2) và dịng thuốc lá khơng chuyển gen cũng đƣợc khảo sát đồng thời để làm đối chứng âm trong thí nghiệm này.
Hình 3.31: Khả năng sinh trƣởng của các dòng thuốc lá chuyển gen T1
Ghi chú: Hình thái của các dịng thuốc lá sinh trưởng ở giai đoạn 4 tuần tuổi. (WT) cây
thuốc lá dại; (V) dòng thuốc lá mang cấu trúc pCAMBIA1301; (TL1, TL4, TL10) dòng thuốc lá mang cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos.
Kết quả quan sát các cây thuốc lá ở giai đoạn 4 tuần tuổi cho thấy khơng có sự khác biệt đáng kể về hình thái và tốc độ sinh trƣởng giữa cây thuốc lá đối chứng khơng chuyển gen (Hình 3.31, dịng WT) và cây thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc khơng mang gen đích pCAMBIA1301 (Hình 3.31, dịng V). Điều này chứng tỏ việc chuyển cấu trúc biểu hiện gen trên vector pCAMBIA1301 vào cây thuốc lá không gây ảnh hƣởng tới khả năng sinh trƣởng của cây. Đối với ba dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF, mặc dù hình thái cây khơng xuất hiện
những đặc điểm bất thƣờng, tốc độ sinh trƣởng của ba dịng cây chuyển gen này có sự khác biệt đáng kể khi đƣợc so sánh với nhau và với hai dòng thuốc lá đối chứng. Quan sát này cho thấy tốc độ sinh trƣởng của cây chuyển gen tỉ lệ nghịch với mức độ biểu hiện của gen OsNLI-IF. Cụ thể, dịng thuốc lá tích lũy protein OsNLI-IF ở
mức cao nhất (dịng TL1) có tốc độ sinh trƣởng chậm nhất, dịng thuốc lá biểu hiện protein OsNLI-IF ở mức thấp (dịng TL10) hoặc khơng biểu hiện protein OsNLI-IF (dịng TL4) có tốc độ sinh trƣởng nhanh hơn và khơng khác biệt lớn so với hai dịng đối chứng (Hình 3.31, dịng TL1, TL4 và TL10). Kết quả này chứng tỏ sự biểu hiện của gen OsNLI-IF đã gây ảnh hƣởng tới khả năng sinh trƣởng của cây thuốc lá
chuyển gen và mức độ tích lũy protein OsNLI-IF trong mơ càng cao sẽ dẫn tới cây sinh trƣởng càng chậm trong điều kiện gieo trồng bình thƣờng (khơng có stress).
Promoter 35S là promoter đƣợc sử dụng phổ biến nhất để điều khiển sự biểu
hiện của gen chuyển trong nghiên cứu chuyển gen thực vật [87]. Tuy nhiên, sự biểu hiện liên tục của một gen, đặc biệt là những gen chức năng hay gen mã hoá nhân tố phiên mã đáp ứng stress thƣờng gây ảnh hƣởng tới sinh trƣởng của cây chuyển gen. Ví dụ, các dịng cây chuyển gen biểu hiện liên tục OsNAC6/SNAC2, OsDREB1A, OsDREB1B, AtDREB1A hay AtDREB1B đều sinh trƣởng chậm và giảm sản lƣợng đáng kể trong điều kiện bình thƣờng so với cây đối chứng khơng chuyển gen [48, 57, 86]. Thông thƣờng, sự biểu hiện liên tục của các gen liên quan tới quá trình truyền tín hiệu ABA có thể làm giảm đáng kể khả năng sinh trƣởng của cây do ABA đóng vai trị trung tâm điều hoà quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật [108]. Maruyama và nhóm nghiên cứu khi nghiên cứu nguyên nhân dẫn tới sự suy giảm sinh trƣởng của các dòng cây chuyển gen mang cấu trúc 35S:DREB1A đã phát hiện ra sự biểu hiện của gen chuyển đã làm tăng cƣờng biểu hiện một số nhân tố phiên mã khác có ảnh hƣởng ức chế quá trình quang hợp và trao đổi carbohydrate [80]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh đƣợc sự biểu hiện liên tục của gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF dƣới sự điểu khiển của promoter 35S cũng làm giảm tốc độ sinh trƣởng của cây thuốc lá chuyển gen, ít nhất là ở giai đoạn cây non 4 tuần tuổi.
Hình 3.32: Khả năng chống chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen
Ghi chú: Cây thuốc lá 4 tuần tuổi được trồng để so sánh hình thái trong điều kiện tưới
nước liên tục (bình thường) và ngừng tưới nước (hạn) trong 1 tháng. Ảnh được chụp tại thời điểm 3 ngày sau khi tưới nước trở lại. Số cây phục hồi sau xử lý hạn được ghi lại. (WT) cây thuốc lá dại; (TL1, TL10) dòng thuốc lá mang cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos.
Các nhân tố phiên mã tƣơng tác với promoter của gen biểu hiện cảm ứng với stress môi trƣờng thƣờng đóng vai trị nhất định trong mạng lƣới điều hoà hoạt động gen đáp ứng stress của tế bào thực vật. Một số gen mã hóa các nhân tố phiên mã này đã đƣợc chứng minh giúp tăng sức chống chịu của cây với điều kiện bất lợi khi đƣợc biểu hiện tăng cƣờng trong cây chuyển gen mơ hình [77, 78, 94, 113]. Để đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện tăng cƣờng protein OsNLI-IF của lúa, các cây thuốc lá chuyển gen T1 đƣợc chúng tôi trồng trong điều kiện stress hạn giả định (khơng tƣới nƣớc) trong một tháng, sau đó tƣới nƣớc trở lại và quan sát khả năng phục hồi (Hình 3.32).