Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR nhân bản OsNLI-IF với cặp mồi SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-
Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2: khuôn là pGEM/OsNLI-IF. (B) Cắt giới hạn pBI-Ubi và pBI-Lip9 bằng SmaI và điện di sản phẩm trên gel agarose 1%; giếng 1 và 2: vector pBI-Ubi; giếng 3 và 4: vector pBI-Lip9; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 4: vector nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Hình 3.22: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc được điện di trên gel agarose 1%. Giếng 1 –
10: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 1 – 9: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp pBI-Ubi/OsNLI-IF số 1 – 9; giếng 11 – 18: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 12 – 18: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp pBI-Lip9/OsNLI-IF số 1 – 7; giếng 10 và 11: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
3.3.2.2. Kiểm tra vector tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF
Để khẳng định sự có mặt đoạn gen OsNLI-IF trên plasmid tái tổ hợp trong các thể biến nạp, DNA plasmid đƣợc tách chiết và kiểm tra bằng PCR và phản ứng
cắt enzyme giới hạn. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu của OsNLI-IF và cặp mồi đặc hiệu của khung vector ch
các băng DNA có kích thƣớc đúng với kích thƣớc lý thuyết, lần lƣợt là 1,3 kb (Hình 3.23A, giếng 2 và 5) và 1,4 kb (Hình 3.23A, giếng 3 và 6). Khi xử lý plasmid tái tổ hợp với enzyme SmaI, sản phẩm phản ứng cho 2 băng DNA trên bản điện di (Hình 3.23B, giếng 1 và 3), trong đó có một băng 1,3 kb tƣơng ứng với đoạn gen OsNLI-
IF, một băng có kích thƣớc lớn hơn 10 kb tƣơng ứng với bộ khung vector. Kết quả
này chứng tỏ plasmid tái tổ hợp thu đƣợc có mang đoạn gen đích OsNLI-IF.
Hình 3.23: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
plasmid tái tổ hợp; giếng 1 – 3: khuôn là pBI-Ubi/OsNLI-IF; giếng 4 – 6: khuôn là pBI- Lip9/OsNLI-IF; giếng 1: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Fw; giếng 2 và 5: PCR với cặp mồi SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 3: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/SmaI-NLI-Fw; giếng 6: PCR với cặp mồi Lip9- Fw/SmaI-NLI-Rv. (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng SmaI; giếng 1 và 2: pBI-
Ubi/OsNLI-IF; giếng 3 và 4: pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 4: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Vector tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF sau đó đƣợc giải trình tự nucleotide với mồi Ubi-Fw (đối với vector pBI-Ubi) hoặc Lip9-Fw (đối với vector pBI-Lip9) và NosT-Rv (cho cả hai vector) để khẳng định chính xác hơn kết quả ghép nối gen OsNLI-IF. Kết quả so sánh trình tự sau khi xử lý bằng phần mềm BioEdit cho thấy trình tự đoạn gen đƣợc ghép nối tƣơng đồng 100% với trình tự đã đƣợc phân lập ban đầu (mục 3.1.3.3); trình tự DNA giải đƣợc có mang đầy đủ promoter Ubiquitin/Lip9 và vùng kết thúc phiên mã NosT. Kết quả này cho phép
khẳng định ghép nối thành công đoạn gen OsNLI-IF vào hệ vector biểu hiện pBI101, đặt dƣới sự điều khiển của hai promoter Lip9 và Ubiquitin.
Ubiquintin là một promoter hoạt động liên tục có nguồn gốc từ cây ngơ đã
đƣợc nghiên cứu chức năng khá chi tiết [26, 29, 91]. Do có khả năng hoạt hố sự biểu hiện gen ở mức độ cao (gấp 10 lần promoter 35S) trong tất cả các mơ/cơ quan có thể quan sát, promoter Ubiquitin đƣợc sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu
chuyển gen ở cây ngũ cốc, đặc biệt là cây lúa [29, 42]. Một số nghiên cứu về gen mã hoá nhân tố phiên mã nhƣ OsDREB1, OsNAC5 hay OsNAC6 cũng đã sử dụng
promoter này cho thí nghiệm chuyển gen vào cây lúa mơ hình [48, 109, 113]. Trong nghiên cứu này, khung đọc mở của OsNLI-IF với trình tự promoter Ubiquitin trên bộ khung vector nhị phân pBI101 để tạo vật liệu cho thí
nghiệm chuyển gen OsNLI-IF vào cây lúa.
Việc sử dụng các promoter hoạt động liên tục nhƣ 35S, Ubiquitin hay Actin… để biểu hiện gen quan tâm trong cây chuyển gen thƣờng mang lại hiệu quả rõ rệt. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp, sự biểu hiện liên tục của một gen đáp ứng điều kiện stress lại gây ảnh hƣởng tiêu cực tới sinh trƣởng và phát triển của thực vật trong điều kiện bình thƣờng [28, 85]. Một giải pháp cho vấn đề này là sử dụng các promoter chỉ cảm ứng hoạt động đặc hiệu trong những điều kiện stress nhất định, ví dụ nhƣ RD29A (A. thaliana), OsNAC6 và OsLEA3-1 (lúa), HVA22 (lúa mạch)... Promoter Lip9 là
một trong số các promoter hoạt động đặc hiệu đƣợc phân lập từ lúa, đã đƣợc chứng minh cảm ứng với điều kiện hạn, mặn và ABA [85]. Các dòng lúa đƣợc chuyển cấu trúc Lip9:OsNAC6 hay Lip9:DREB1A bên cạnh khả năng chịu hạn cao cịn có tốc độ sinh trƣởng trong điều kiện bình thƣờng cao hơn rõ rệt so với các dòng lúa biểu hiện liên tục gen chuyển, chứng tỏ sự hoạt động của promoter Lip9 không gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây chuyển gen [85, 113]. Trong nghiên cứu này, cấu trúc biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF đặt dƣới sự điều khiển của promoter
Lip9 đã đƣợc thiết kế để phục vụ cho các nghiên cứu sau này hƣớng tới mục tiêu tạo
ra giống cây trồng chuyển gen chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của môi trƣờng, đồng thời vẫn cho năng suất ổn định trong điều kiện bình thƣờng.
3.4. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN
3.4.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A. tumefaciens LBA4404
Để thực hiện thí nghiệm chuyển gen vào cây mơ hình, các chủng vi khuẩn
A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc biểu hiện gen (Ti-plasmid) đƣợc tạo ra bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt và sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho OsNLI-IF. Sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc A. tumefaciens đƣợc biến nạp cấu trúc biểu hiện OsNLI-IF với cặp mồi EcoRI-NLI- Fw/XhoI-NLI-Rv (đối với hệ vector pCAMBIA1301) hoặc SmaI-NLI-Fw/SmaI- NLI-Rv (đối với hệ vector pBI101) khi đƣợc điện di trên gel agarose cho 1 băng DNA duy nhất 1,3 kb tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của gen đích (Hình 3.24A, giếng 6-9; Hình 3.24B, giếng 2-4; Hình 3.25, giếng 1-10). Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã thu đƣợc các thể biến nạp A. tumefaciens có mang cấu trúc biểu hiện gen
OsNLI-IF điểu khiển bởi các promoter khác nhau (bao gồm pCAM/OsNLI-IF-S,
pCAM/OsNLI-IF-AS, pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF).
Hình 3.24: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc A. tumefaciens với cặp mồi EcoRI-NLI-
Fw/XhoI-NLI-Rv được điện di trên gel agarose 1%. (A) Khuẩn lạc được biến nạp pCAM/OsNLI-IF-S; giếng 1: đối chứng dương (khuôn là pCAM/OsNLI-IF-S); giếng 2: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 3 – 9: khn là thể biến nạp pCAM/OsNLI-IF-S số 1 – 7. (B) Khuẩn lạc được biến nạp pCAM/OsNLI-IF-AS; giếng 1: đối chứng dương (khuôn là pCAM/OsNLI-IF-AS); giếng 2 – 4: khuôn là thể biến nạp pCAM/OsNLI-IF-AS số 1 – 3; giếng 5: đối chứng âm (khơng có DNA khn). Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Bên cạnh các vector có mang cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF, các vector
biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens để làm đối chứng âm trong thí nghiệm nghiên cứu chức năng OsNLI-IF trong cây chuyển gen. Các thể biến nạp sau đó cũng đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng cấu trúc vector (Phụ lục 12). Các thể biến nạp có kết quả PCR dƣơng tính đƣợc chọn để sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen vào cây mơ hình tiếp theo.
Hình 3.25: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI-Lip9/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc A. tumefaciens với cặp mồi SmaI-NLI-
Fw/SmaI-NLI-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1 – 5: khuôn là các khuẩn lạc mang vector pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 6 – 10: khuôn là các khuẩn lạc mang vector pBI- Ubi/OsNLI-IF; giếng 11: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 12: đối chứng dương (khuôn là pGEM/OsNLI-IF). Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
3.4.2. Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây thuốc lá
3.4.2.1. Chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào thuốc lá
Phân tích biểu hiện gen trên cây chuyển gen mơ hình là một phƣơng pháp cơ bản để nghiên cứu chức năng gen, đƣợc áp dụng trong tất cả các nghiên cứu trƣớc đây về nhân tố phiên mã. Hầu hết các nghiên cứu này đều sử dụng đối tƣợng cây mơ hình A. thaliana hoặc thuốc lá (Nicotiana tabacum) cho thí nghiệm chuyển gen [61, 64, 94, 132, 133]. Ƣu điểm chính của hai lồi này là có khả năng tái sinh cao trên mơi trƣờng ni cấy in vivo và đều là vật chủ tự nhiên của A. tumefaciens, do đó đƣợc sử dụng rất phổ biến trong các thí nghiệm chuyển gen thực vật.
Trong nghiên cứu này, để xác định chức năng của nhân tố phiên mã OsNLI-IF trong điều kiện in vivo, chúng tơi tiến hành thí nghiệm chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-
IF vào cây thuốc lá (Hình 3.26A-F). Ngồi ra, trong thí nghiệm này, cấu trúc
sử dụng làm đối chứng âm trong thí nghiệm phân tích biểu hiện của gen đích. Một số dịng cây tái sinh từ mỗi thí nghiệ ợc chọn ra ngẫu nhiên để tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen bằng PCR với cặp mồi 35S-Fw/GUS-t-Rv (đối với cấu trúc pCAMBIA1301) và NLI-t-Fw/ NOS-Rv (đối với cấu trúc 35S:OsNLI-IF-S).
Hình 3.26: cấu trúc gen 35S:OsNLI-IF vào cây thuốc lá
Ghi chú: (A) Mảnh lá ngâm trong môi trường tiền nuôi cấy. (B) Mảnh lá trên mơi trường
chọn lọc có bổ sung Hygromycin 30 mg/l. (C) Mơ sẹo hình thành và tái sinh chồi trên mơi trường tái sinh có Hygromycin 30 mg/l. (D) Chồi thuốc lá tái sinh trên môi trường tái sinh sau 27 ngày. (E) Cây thuốc lá tái sinh trên môi trường kéo dài chồi. (F) Cây thuốc lá trên môi trường tạo rễ. (G) Cây thuốc lá đưa ra đất trồng trong túi giữ ẩm. (H) Cây thuốc lá trồng trong chậu đất trong nhà kính. (I) Cây thuốc lá được bao kín hoa để tự thụ phấn.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy toàn bộ các mẫu kiểm tra đều cho 1 băng DNA đặc hiệu có kích thƣớc đúng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết: băng DNA 0,9 kb đối với mẫu DNA tách chiết từ dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc pCAMBIA1301 (Hình 3.27A, giếng 2-10), băng DNA 0,4 kb đối với mẫu DNA tách chiết từ dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF-S. Ngƣợc lại, đối với PCR sử dụng khuôn là mẫu DNA tách chiết từ cây thuốc lá không chuyển gen, sản phẩm PCR không cho 2 băng DNA này. Kết quả này chứng tỏ các dòng thuốc lá tái sinh đƣợc kiểm tra có mang cấu trúc biểu hiện gen đích.
Hình 3.27: PCR kiểm tra các dịng thuốc lá tái sinh
Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR kiểm tra cây chuyển gen pCAMBIA1301 với cặp mồi 35S-
Fw/GUS-t-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1: đối chứng âm (khuôn là DNA tách chiết từ cây thuốc lá dại), giếng 2 – 10: khuôn là mẫu DNA tách chiết từ các dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301; giếng 11: đối chứng dương (khuôn là
pCAMBIA1301). (B) Sản phẩm PCR kiểm tra cây chuyển gen pCAM/OsNLI-IF-S với cặp
mồi NLI-t-Fw/Nos-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1: đối chứng âm (khuôn là DNA tách chiết từ cây thuốc lá dại), giếng 2: đối chứng dương (khuôn là pCAM/OsNLI-IF- S); giếng 3 – 11: khn là mẫu DNA tách chiết từ các dịng thuốc lá được chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
10 dòng cây tái sinh đƣợc chuyển cấu trúc pCAMBIA1301 (đặt tên là ĐC1 – ĐC10) và 10 dòng cây tái sinh đƣợc chuyển cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF (đặt tên là TL1-TL10) có kết quả PCR dƣơng tính từ mỗi thí nghiệm chuyển gen đƣợc chúng tôi chọn lọc ngẫu nhiên để sử dụng cho các thí nghiệm phân tích biểu hiện gen tiếp theo. Các dòng cây tái sinh này đƣợc chuyển ra trồng trong chậu đất và tiếp tục cho sinh trƣởng trong điều kiện nhà kính để thu hạt phục vụ thí nghiệm phân tích cây T1 (Hình 3.26G, H & I).
3.4.2.2. Phân tích khả năng nảy mầm của các dịng thuốc lá chuyển gen
Quá trình chuyển DNA ngoại lai vào hệ gen tế bào thực vật có thể gây ra một số xáo trộn trong hệ thống điều hoà hoạt động gen của tế bào, làm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây chủ. Ngồi ra, trong thí nghiệm chuyển gen vào thuốc lá chúng tôi sử dụng hệ vector pCAMBIA1301 nên các dòng cây tái sinh sẽ có mang gen chọn lọc kháng Hygromycin. Do đó, khả năng nảy mầm của các dòng thuốc lá chuyển gen đã đƣợc khảo sát trên hai loại môi trƣờng dinh dƣỡng: mơi trƣờng MS bình thƣờng và mơi trƣờng MS có bổ sung chất kháng sinh Hygromycin 50 mg/l.
ly tính trạng), các dịng thuốc lá chuyển gen có tỉ lệ nảy mầm cao trên mơi trƣờng dinh dƣỡng bình thƣờng (>95%) đƣợc tiếp tục khảo sát khả năng nảy mầm trên mơi trƣờng có Hygromycin (Phụ lục 13). Ngoài ra, nhằm loại bỏ những dòng cây chuyển gen có mang nhiều bản sao của cấu trúc biểu hiện gen đích trên các NST khác nhau, chúng tôi chọn lọc các dịng có tỉ lệ phân ly kiểu hình [kháng Hygromycin] : [không kháng Hygromycin] đạt xấp xỉ 3:1. Kết quả thu đƣợc cho thấy các dòng TL1, TL3, TL4, TL7, TL8, TL10 và ĐC2, ĐC3, ĐC8, ĐC9 có tỉ lệ nảy mầm đạt 65 – 85 % (Bảng 3.6), gần với tỉ lệ phân ly 3:1. Các cây thuốc lá T1 kháng Hygromycin từ các dòng này đƣợc chọn lọc để tiếp tục phân tích đặc điểm di truyền.
Bảng 3.5: Tỉ lệ nảy mầm của các dịng thuốc lá T1 trên mơi trƣờng MS.
Tên dòng Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt Tỉ lệ % Tên dòng Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt Tỉ lệ % TL1 48/50 96,0 ĐC1 40/52 76,9 TL2 45/51 88,2 ĐC2 45/47 95,7 TL3 53/55 96,4 ĐC3 51/53 96,2 TL4 47/49 95,9 ĐC4 52/53 98,1 TL5 31/55 56,4 ĐC5 50/54 92,6 TL6 12/50 24,0 ĐC6 49/52 94,2 TL7 49/50 98,0 ĐC7 48/52 92,3 TL8 53/55 96,4 ĐC8 48/48 100 TL9 52/55 94,6 ĐC9 49/50 98,0 TL10 47/48 97,9 ĐC10 47/53 88,7
TL: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF. ĐC: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301.
thí nghiệm chuyển gen thực vật sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens, mặc dù tần suất chuyển gen khá thấp nhƣng T-DNA vẫn có thể chèn vào hai hoặc nhiều vị trí khác nhau trong hệ gen tế bào chủ [19]. Chính vì vậy, đối với các đối tƣợng thực vật là loài tự thụ phấn, ở thế hệ con lai F1 có thể xuất hiện tỉ lệ phân ly kiể
3:1, 15:1 hoặc những tỉ lệ phân ly bất thƣờng khác [89]. Phƣơng pháp sàng lọc cây chuyển gen T1 dựa trên sự phân ly kiểu hình biểu hiện của gen chọn lọc đã đƣợc một số nghiên cứu trƣớc đây áp dụng để xác định những dịng cây chuyển gen có mang một bản sao của gen đích [63, 114, 115]. Ở đây, chúng tôi cũng sàng lọc các
dòng cây chuyển gen T1 bằng phƣơng pháp gieo hạt trên mơi trƣờng có Hygromycin 50 mg/l. Mặc dù chƣa thể khẳng định các dịng cây chuyển gen đƣợc chọn có mang duy nhất một bản sao của cấu trúc T-DNA, tỉ lệ phân ly giữa các cây kháng và không