Dòng thuốc lá Cấu trúc biểu hiện gen
Tỉ lệ cây sống sót Tƣới nƣớc1
Khơng tƣới nƣớc2
Đối chứng Không chuyển gen 35/35
(100%) 6/36 (16%) ĐC2 pCAMBIA1301 36/36 (100%) 3/36 (8%) TL1 35S:OsNLI-IF 35/36 (97%) 20/36 `(56%) TL4 35S:OsNLI-IF 36/36 (100%) 8/36 (22%) TL10 35S:OsNLI-IF 36/36 (100%) 27/36 (75%) (1)
Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và tưới nước hàng ngày.
(2)
Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và không tưới nước liên tục trong 1 tháng, sau đó tưới nước trở lại liên tục trong 3 ngày.
Kết quả thể hiệ 3.32 và bảng 3.8 cho thấy dòng thuốc lá TL10 biểu hiện protein đích OsNLI-IF ở mức độ thấp có khả năng chống chịu hạn cao nhất với tỉ lệ cây phục hồi sau stress hạn chiếm 75% tổng số cây đƣợc kiểm tra. Khả năng chịu hạn của dịng thuốc lá TL1 (có gen OsNLI-IF biểu hiện mạnh) thấp hơn so với dòng thuốc lá TL10, với 20/36 cây phục hồi sau thí nghiệm xử lý hạn (56%). Đặc biệt, tỉ lệ sống sót của các cây thuốc lá có biểu hiện protein OsNLI-IF cao hơn rõ rệt so với dòng đối chứng khơng chuyển gen (16%) cũng nhƣ dịng ĐC2 đƣợc chuyển
cấu trúc pCAMBIA1301 không mang gen (8%) hay dòng TL4 đƣợc chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF nhƣng khơng biểu hiện gen đích (8%).
Cho đến nay đã có một số lƣợng lớn các gen mã hóa nhân tố phiên mã tham gia vào mạng lƣới điều hòa hoạt động gen đáp ứng điều kiện môi trƣờng bất lợi đƣợc phát hiện và phân lập ở lúa. Nhiều gen trong số này khi đƣợc biểu hiện liên tục dƣới sự điều khiển của một promoter hoạt động mạnh có thể tăng cƣờng khả năng chống chịu stress phi sinh học của cây chuyển gen hai lá mầm. Ví dụ, sự biểu hiện của ONAC063, OsWRKY45 hay OsWRKY72 (của lúa) dƣới sự điều khiển của
promoter 35S làm tăng khả năng chịu hạn, mặn và nhiệt độ cao của cây A. thaliana chuyển gen [25, 128]. Tƣơng tự, cây bông đƣợc chuyển gen SNAC1 (của lúa) hay cây thuốc lá đƣợc chuyển gen TaWRKY10 (của lúa mì) cũng thể hiện tính chịu hạn và mặn cao hơn so với cây không chuyển gen [75, 118]. Các thực tế này cho thấy trong tế bào của các loài thực vật một lá mầm và hai lá mầm có thể tồn tại nhiều con đƣờng điều hoà biểu hiện gen đáp ứng với điều kiện stress tƣơng tự nhau, chứng tỏ cơ chế điều hồ đáp ứng chống chịu stress có tính bảo thủ cao giữa hai nhóm thực vật này. Dubouzet và nhóm nghiên cứu đã chứng minh sự biểu hiện tăng cƣờng
OsDREB1A (của lúa) trong cây A. thaliana chuyển gen đã hoạt hóa sự biểu hiện của
một loạt gen đích đƣợc điều hịa bởi nhân tố phiên mã DREB1A (của A. thaliana)
[36]. Kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu này đã ủng hộ thêm cho giả thuyết trên, các dòng thuốc lá biểu hiện gen OsNLI-IF (phân lập từ lúa) có tỉ lệ sống sót sau giai đoạn xử lý hạn cao hơn rõ rệt so với dịng khơng chuyển gen và dịng khơng biểu hiện gen đích (Hình 3.32). Mặc dù vẫn cần có những thí nghiệm phân tích sâu hơn để làm rõ cơ chế điều hoà của nhân tố phiên mã OsNLI-IF, kết quả thí nghiệm của chúng tơi đã bƣớc đầu chứng minh OsNLI-IF có tham gia vào q trình đáp ứng chống chịu hạn của thực vật.
3.4.3. Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây lúa chuyển gen
3.4.3.1. Chuyển cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF vào lúa
Để nghiên cứu vai trò của nhân tố phiên mã OsNLI-IF trong đáp ứng chống chịu hạn của cây lúa, chúng tơi đã thực hiện thí nghiệm chuyển gen OsNLI-IF vào lúa.
Mơ sẹo hình thành từ hạt lúa đƣợc lần lƣợt chuyển các cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF (Ubi:OsNLI-IF, Lip9:OsNLI-IF, 35S:OsNLI-IF-S, 35S:OsNLI-IF-AS) và các cấu trúc
vector nhị phân không mang gen đích (pCAMBIA1301, pBI-Ubi, pBI-Lip9), sau đó đƣợc chọn lọc và tái sinh trên môi trƣờng nuôi cấy in vitro (Hình 3.33). Kết quả
chuyển nạp gen trình bày trong bảng 3.9 cho thấy tỉ lệ tái sinh của giống lúa Indica khá thấp, chỉ có 141 dịng lúa tái sinh từ 3.500 hạt đƣợc ni cấy tạo mơ sẹo (đạt 4%). Sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen quan tâm trong các dòng lúa tái sinh đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu của từng cấu trúc (Bảng 3.9, Phụ lục 18). Kết quả thu đƣợc cho thấy có 138/141 dịng lúa tái sinh cho kết quả PCR dƣơng tính; chứng tỏ các cấu trúc biểu hiện gen đích đã đƣợc chuyển thành cơng vào lúa.
Hình 3.33: cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF vào lúa
Ghi chú: (A) Mơ sẹo hình thành từ phơi trưởng thành trên môi trường MS tạo mô sẹo. (B)
Đồng nuôi cấy mô sẹo và vi khuẩn Agrobacterim mang gen OsNLI-IF. (C) Mô sẹo trên môi trường chọn lọc có Hygromycin 50 mg/l và Cefotaxim 250 mg/l. (D) Mô sẹo trên mơi trường tái sinh có Hygromycin 30 mg/l và Cefotaxim 250 mg/l. (E) Chồi tái sinh trên môi trường tái sinh. (F) Chồi lúa non trên mơi trường tạo rễ.
Các cây lúa tái sinh hồn chỉnh mang gen đích đƣợc chuyển sang trồng trong chậu đất để thu hạt. Trong số các dòng lúa tái sinh đƣợc trồng trong chậu đất, chỉ có 7/23 dịng mang cấu trúc Lip9:OsNLI-IF, 38/49 mang cấu trúc Ubi:OsNLI-IF, 1/7
dòng mang cấu trúc pBI-Ubi và 3/19 dòng mang cấu trúc pCAMBIA1301 có khả năng sinh trƣởng bình thƣờng trong điều kiện nhà kính; các dịng cây cây chuyển gen cịn lại đều chết ở các giai đoạn khác nhau. Tuy nhiên, dù sinh trƣởng bình
thƣờng và có kiểu hình khơng khác biệt so với cây lúa đối chứng không chuyển gen, đa số các dịng lúa chuyển gen khơng thể trổ bơng và kết hạt bình thƣờng; chỉ có 16 dịng đƣợc chuyển cấu trúc Ubi:OsNLI-IF có khả năng kết hạt bình thƣờng, nảy
mầm thành cây chuyển gen thế hệ T1 (Bảng 3.9).