Ghi chú: Sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lạc mang các dòng cDNA khác nhau được điện di
trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1 – 11: khuôn là các khuẩn lạc; giếng 12: đối chứng âm (khơng có DNA khn).
Theo quy trình sàng lọc gen bằng kỹ thuật Y1H, nồng độ thƣ viện tối thiểu cần đạt từ 105 –106 cfu/ml và có mang các đoạn cDNA có kích thƣớc từ 0,5 – 2 kb [27]. Nhƣ vậy, thƣ viện cDNA thứ cấp chúng tôi tạo đƣợc trong nghiên cứu này đảm bảo yêu cầu để sử dụng cho thí nghiệm sàng lọc gen bằng kỹ thuật Y1H.
3.1.2. Phân lập gen mã hoá nhân tố phiên mã bằng kỹ thuật Y1H
3.1.2.1. Thiết kế vector chỉ thị mang đoạn DNA đích
Kỹ thuậ ất phổ biến trong phân lập và nghiên cứu chức năng của nhân tố phiên mã. Đối với thí nghiệm sàng lọc thƣ viện cDNA bằng Y1H, việc xác định trình tự của đoạn DNA đích có ý nghĩa quyết định sự thành cơng của thí
nghiệm. Trong nghiên cứ ịnh trình tự dựa trên cơ
sở các kết quả nghiên cứu của Rabbani và nhóm nghiên cứu về mơ hình biểu hiện của một số gen ở lúa trong các điều kiện stress phi sinh học khác nhau [96]. Khi phân tích trình tự promoter của tất cả các gen cảm ứng stress này, ngoài một số yếu tố hoạt hoá
cis liên quan tới điều hồ hoạt động gen đã đƣợc cơng bố nhƣ DRE, ABRE, NACRS,
W-box và G-box, hai motif có trình tự là CCTCCTCC và CTCCAC đƣợc tìm thấy xuất hiện lặp lại nhiều lần trong vùng promoter của nhiều gen và đƣợc dự đoán là những yếu tố cis điều hòa biểu hiện gen trong điều kiện stress. Đặc biệt, vùng
promoter của hai gen JRC0528 (cảm ứng stress hạn, mặn, lạnh, ABA) và JRC0332
(Phụ lục 2). Chính vì vậy, chúng tơi đã sử dụng hai đoạn DNA kích thƣớc 50 bp đƣợc tổng hợp hóa học dựa trên trình tự của hai promoter JRC0528 và JRC0332 có cả chứa hai motif này, đặt tên là JRC0332 và JRC0528, làm “mồi câu” trong thí nghiệm sàng lọc gen mã hố nhân tố phiên mã từ thƣ viện cDNA bằng kỹ thuật Y1H (Hình 3.3A).