Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen OsNLI-IF trong cây lúa đã xử lý stress để khơ trong khơng
khí (mất nước), hạn (PEG 20%), mặn (NaCl 200 mM), lạnh (4oC), nóng (42oC) và hormone (ABA 100 µM) trong thời gian 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ được xác định bằng Real-time PCR, sử dụng khuôn là RNA tách chiết từ mô thân/lá (cột màu đỏ) và mơ rễ (cột màu tím). Mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử lý stress (0 h) có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm.
Trong hơn hai thập kỉ qua, đã có rất nhiều nghiên cứu chi tiết về mơ hình biểu hiện của các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu
yếu tố stress phi sinh học ở thực vật đã đƣợc thực hiện. Kết quả thu đƣợc từ các nghiên cứu đã cho thấy mơ hình biểu hiện của các gen này rất đa dạng và không phụ thuộc vào loài thực vật hay cấu trúc cũng nhƣ chức năng của sản phẩm protein [14, 93]. Nhiều nhân tố phiên mã đƣợc xếp vào cùng một họ và một nhóm dựa theo sự tƣơng đồng về cấu trúc nhƣng đáp ứng với các yếu tố stress khác nhau trong các đối tƣợng thực vật khác nhau [82]; ví dụ nhƣ ZmDBF1 (ngô) biểu hiện đáp ứng với stress mất nƣớc và mặn [61], AhDREB1 (Atriplex hortensis) tham gia vào con đƣờng đáp ứng hạn và mặn [104], GmDREBb (đậu tƣơng) phiên mã mạnh trong
điều kiện stress lạnh, hạn và mặn [72], AtRap2.4 (A. thaliana) đƣợc tăng cƣờng biểu hiện bởi yếu tố stress hạn và mặn, nhƣng giảm trong điều kiện stress ánh sáng [73]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra sự biểu hiện của gen OsNLI-IF ở
lúa đƣợc tăng cƣờng bởi hầu hết tất cả yếu tố stress phi sinh học, bao gồm cả mặn, hạn, mất nƣớc, lạnh và nhiệt độ cao (Hình 3.7), chứng tỏ OsNLI-IF có thể là một protein có nhiều chức năng quan trọng tham gia vào hệ thống đáp ứng điều kiện ngoại cảnh bất lợi của tế bào thực vật, trong đó có điều kiện khơ hạn.
Bên cạnh đặc điểm biểu hiện cảm ứng điều kiện stress, nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã điều hòa biểu hiện của các gen đáp ứng điều kiện stress cịn biểu hiện đặc hiệu mơ và biểu hiện tƣơng quan với thời gian tiếp xúc yếu tố stress.
AhDREB1 đƣợc điều hòa bởi yếu tố stress mặn nhƣng chỉ biểu hiện ở mô rễ; OsDREB1F đƣợc biểu hiện liên tục trong hầu hết các mô và cơ quan khác nhau
nhƣ lá non, rễ non, lá trƣởng thành, rễ trƣởng thành và mô sẹo; GmDREBa và GmDREBb cũng đƣợc biểu hiện trong lá cây đậu tƣơng dƣới điều kiện hạn, mặn
và lạnh, trong khi GmDREBc chỉ biểu hiện ở rễ trong điều kiện hạn, mặn và ABA [23]. Dựa trên kết quả phân tích bằng Real-time PCR (Hình 3.7), gen OsNLI-IF
bƣớc đầu đƣợc xác định biểu hiện đặc hiệu trong mô rễ của cây lúa non dƣới các điều kiện stress phi sinh học liên quan tới áp suất thẩm thấu và nhiệt độ.
Nhiều tác giả khi nghiên cứu về cơ chế chống chịu yếu tố stress phi sinh học của thực vật đã đƣa ra kết luận trong tế bào tồn tại ít nhất hai con đƣờng điều hồ hoạt động gen cơ bản đáp ứng với yếu tố stress: (i) con đƣờng điều hoà phụ
thuộc ABA và (ii) con đƣờng điều hòa không phụ thuộc ABA [74, 82]. Sự biểu hiện của đa số các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu yếu tố stress phi sinh học thuộc họ bZIP và MYB đƣợc điều hòa theo con đƣờng phụ thuộc tín hiệu ABA, trong khi nhiều gen thuộc phân họ DREB đã đƣợc chứng minh cảm ứng biểu hiện theo con đƣờng điều hòa khơng phụ thuộc tín hiệu ABA [52]. Ngồi ra, các thành viên của một số họ gen khác nhƣ NAC, WRKY và ZF
đƣợc xác định có liên quan tới cả hai con đƣờng điều hịa hoạt động gen phụ thuộc và khơng phụ thuộc tín hiệu ABA [74]. Bằng kỹ thuật Real-time PCR chúng tôi đã chứng minh OsNLI-IF đƣợc cảm ứng biểu hiện bởi nhiều yếu tố stress phi sinh
học khác nhau theo con đƣờng khơng phụ thuộc vào tín hiệu ABA (Hình 3.7).
3.2.2. Hoạt tính liên kết đặc hiệu với đoạn DNA đích của protein OsNLI-IF
Một protein đóng vai trò là một nhân tố phiên mã trong tế bào phải có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hay một vài trình tự DNA nhất định. Trong thí nghiệm sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA, gen OsNLI-IF đã đƣợc phân lập trong cả
hai thí nghiệm sàng lọc gen sử dụng hai đoạn DNA đích khác nhau (JRC0332 và JRC0528) có kích thƣớc 50 bp mang hai motif CCTCCTCC và CTCCAC; kết quả này cho thấy protein OsNLI-IF có thể nhận biết đƣợc đồng thời cả hai đoạn DNA đích này. Để chứng minh cho giả thuyết này, chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật Y1H, trong đó trình tự DNA mã hố protein OsNLI-IF đƣợc ghép nối với trình tự mã hố domain hoạt hoá phiên mã AD-GAL4 trên vector biểu hiện pAD-GAL4 để biểu hiện protein dung hợp trong tế bào nấm men. Khi đó, OsNLI-IF sẽ đóng vai trị là domain (vùng chức năng) liên kết DNA để tƣơng tác với promoter của hai gen
HIS3 và lacZ trên vector chỉ thị pHISi và pLacZi và hoạt hố q trình phiên mã.
3.2.2.1. Ghép nối đoạn gen OsNLI-IF vào vector pAD-GAL4
Đoạn gen OsNLI-IF trên vector pGEM/OsNLI-IF đƣợc ghép nối vào vị trí nhận biết của EcoRI/XhoI trên vector pAD-GAL4 (Phụ lục 1). Hai đoạn DNA kích thƣớc 1,3 kb (tƣơng ứng với đoạn gen OsNLI-IF) và 7,7 kb (tƣơng ứng với vector
pAD-GAL4 mạch thẳng) thu đƣợc từ sản phẩm cắt giới hạn vector pGEM/OsNLI- IF và pAD-GAL4 đƣợc tinh sạch, ghép nối và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
Các thể biến nạp xuất hiện trên môi trƣờng chọn lọc sàng lọc bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu của gen đích. Kết quả thu đƣợc cho thấy một số khuẩn lạc có mang đoạn gen OsNLI-IF, sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc này khi
đƣợc điện di trên gel agarose 1% cho 1 băng DNA duy nhất có kích thƣớc 1,3 kb (Hình 3.8B, giếng 1, 3 và 4) tƣơng tự nhƣ phản ứng đối chứng dƣơng sử dụng vector pGEM/OsNLI-IF làm khn (Hình 3.8B, giếng 7).