Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CU & THẢO LUẬN
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF
3.3.1. Thiết kế hệ vector biểu hiện pCAMBIA1301
Để phục vụ thí nghiệm nghiên cứu chức năng in vivo của OsNLI-IF trong cây chuyển gen, chúng tôi tiến hành thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF, sử dụng promoter hoạt động liên tục 35S. Trình tự mã hoá của OsNLI-IF đƣợc ghép nối vào vector trung gian pRT101tại vị trí nằm giữa promoter 35S và vùng tín hiệu kết thúc phiên mã (poly-A); cấu trúc biểu hiện gen 35S:OsNLI-IF sau đó đƣợc cắt và ghép nối vào vector nhị phân pCAMBIA1301 theo sơ đồ trình bày trong hình 2.2.
3.3.1.1. Thiết kế cấu trúc biểu hiện OsNLI-IF điều khiển bởi promoter 35S
Vector pRT101 là một vector nhân dòng trung gian đƣợc thiết kế mang vùng MCS nằm giữa trình tự promoter 35S và trình tự tín hiệu kết thúc phiên mã poly-A
[111]. Trong thí nghiệm này, đoạn gen OsNLI-IF 1,3 kb đƣợc chúng tơi cắt khỏi vector nhân dịng pGEM/OsNLI-IF và ghép nối vào vị trí nhận biết của enzyme
EcoRI trên vector pRT101 (Hình 2.2 & Hình 3.17A). Hỗn hợp phản ứng ghép nối
DNA bằng T4 DNA ligase đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α; thể biến nạp xuất hiện trên mơi trƣờng LB có Ampicillin sau đó đƣợc sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR
trực tiếp khuẩn lạc với đồng thời hai cặp mồi 35S-Fw/EcoRI-NLI-Rv và 35S- Fw/XhoI-NLI-Fw (Bảng 2.1) để xác định chiều của gen OsNLI-IF trên vector tái tổ hợp. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose cho thấy trong số 5 khuẩn lạc đƣợc kiểm tra có 2 khuẩn lạc mang đoạn gen OsNLI-IF xuôi chiều, sản phẩm PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Fw cho 1 băng DNA 1,4 kb (Hình 3.17B, giếng 7 9) và 3 khuẩn lạc mang đoạn gen OsNLI-IF ngƣợc chiều có kết quả PCR dƣơng tính với cặp mồi 35S-Fw/EcoRI-NLI-Rv (Hình 3.17B, giếng 2, 4 5).
Hình 3.17: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pRT101
Ghi chú: (A) Cắt giới hạn pGEM/OsNLI-IF và pRT101 bằng EcoRI và điện di sản phẩm
trên gel agarose 1%; giếng 1 và 2: pGEM/OsNLI-IF; giếng 3 và 4: pRT101; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 4: vector nguyên bản. (B) PCR trực tiếp khuẩn lạc và điện di trên gel agarose 1%; giếng 1 – 6: PCR với cặp mồi 35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 7 – 12: PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv: giếng 1 – 5 và 7 – 11: khuôn là khuẩn lạc số 1 – 5; giếng 6 và 12: đối chứng âm (khơng có DNA khn). Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Để khẳng định sự có mặt của đoạn gen OsNLI-IF trong vector tái tổ hợp,
DNA plasmid đƣợc tinh sạch từ các thể biến nạp dƣơng tính và kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR và cắt giới hạn. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy với PCR sử dụng cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv, cả 2 plasmid tái tổ hợp đều cho băng DNA khoảng 1,3 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của OsNLI-IF (Hình 3.17A, giế 4). Trong khi đó, với cặp mồi 35S-Fw/ XhoI-NLI-Rv hay 35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw, chỉ có sản phẩm PCR từ vector mang đoạn gen tƣơng ứng OsNLI-IF xuôi chiều (pR101/OsNLI-IF-S) hay ngƣợc chiều (pR101/OsNLI-IF-S) cho kết quả dƣơng tính (35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw) (Hình 3.18A, giế 5). Trong thí nghiệm xử lý hai vector tái tổ hợp bằng PstI, kết
vector pRT101) và 2,0 kb (tƣơng ứng với kích thƣớc cấu trúc biểu hiện gen
35S:OsNLI-IF:Poly-A) (Hình 3.18B, giế 3). Các kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã thu đƣợc vector tái tổ hợp mang đoạn gen đích OsNLI-IF. Cả hai cấu trúc sẽ đƣợc sử dụng để thiết kế vector biểu hiện pCAMBIA1301 mang trình tự có nghĩa (sense) và đối nghĩa (antisense) của gen OsNLI-IF.
Hình 3.18: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pRT/OsNLI-IF-S và pRT/OsNLI-IF-AS
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
plasmid tái tổ hợp; giếng 1 và 4: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2 và 5: PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 3 và 6: PCR với cặp mồi 35S- Fw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 1 – 3: khuôn là pRT/OsNLI-IF-S; giếng 4 – 6: khuôn là pRT/OsNLI-IF-AS. (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng PstI ; giếng 1 và 2:
pRT/OsNLI-IF-S; giếng 3 và 4: pRT/NLI-IF-AS; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 4: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
3.3.1.2. Ghép nối cấu trúc biểu hiện OsNLI-IF vào vector pCAMBIA1301
Vector pCAMBIA1301 là một Ti plasmid (Tumor inducing plasmid) nhân tạo có mang cấu trúc biểu hiện gen chọn lọc kháng Hygromycin và vùng MCS đƣợc thiết kế để biểu hiện gen quan tâm trong tế bào thực vật (Hình 2.2). Trong thí nghiệm này, các vector pR101/OsNLI-IF-S, pR101/OsNLI-IF-AS và vector pCAMBIA1301 đã đƣợc lần lƣợt xử lý với enzyme HindIII; hai cấu trúc 35S:OsNLI-IF-S và 35S:OsNLI-IF-AS sau đó đƣợc ghép nối vào vector nhị phân
pCAMBIA1301 (Hình 3.19A). Hỗn hợp phản ứng ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α và nuôi cấy trên mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung kháng sinh Kanamycin (100 µg/ml). Kết quả kiểm tra các thể biến nạp bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv
cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc một số khuẩn lạc dƣơng tính có mang đoạn gen đích OsNLI-IF (Hình 3.19B, giếng 1-7 và 9-15).
Hình 3.19: Ghép nối cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào vector pCAMBIA1301
Ghi chú: (A) Cắt giới hạn pCAMBIA1301, pRT/OsNLI-IF-S và pRT/OsNLI-IF-AS bằng
HindIII và điện di sản phẩm trên gel agarose 1%; giếng 1 và 2: pCAMBIA1301; giếng 3 và 4: pRT/OsNLI-IF-S; giếng 5 và 6: pRT/OsNLI-IF-AS; giếng 1, 4 và 6: vector nguyên bản; giếng 2, 3 và 5: sản phẩm cắt giới hạn. (B) Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với
cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1 – 7: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp pCAM-35S/OsNLI-IF-S số 1 – 7; giếng 9 – 15: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp pCAM-35S/OsNLI-IF-AS số 1 – 7; giếng 8 và 16: đối chứng âm (khơng có DNA khn). Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Để khẳng định kết quả thu đƣợc, plasmid đƣợc tinh sạch từ các khuẩn lạc dƣơng tính và kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi khác nhau và bằng enzyme giới hạn HindIII và EcoRI. Kết quả điện di sản phẩm PCR với ba cặp mồi EcoRI-NLI- Fw/XhoI-NLI-Rv, 35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw hoặc 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv, 35S- Fw/GUS-Rv cho thấy sự xuất hiện của các băng DNA có kích thƣớc lần lƣợt 1,3 kb, 1,4 kb và 0,9 kb tƣơng ứng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết của từng đoạn DNA (Hình 3.20A & B, giếng 1-3). Đối với thí nghiệm cắt giới hạn bằng enzyme HindIII, sản phẩm phản ứng cho 2 băng DNA, trong đó băng DNA có kích thƣớc 2,0 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của cấu trúc 35S:OsNLI-IF (Hình 3.20A & B, giếng 5).
Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện pCAMBIA1301 mang trình tự có nghĩa (sense) hay đối nghĩa (antisense) của gen
OsNLI-IF, đặt dƣới sự điều khiển của promoter 35S. Kết luận này đƣợc khẳng định
hơn nhờ thí nghiệm xử lý vector tái tổ hợp với enzyme EcoRI, trong đó sản phẩm
cắt giới hạn khi đƣợc điện di trên gel agarose 1% cho 3 băng DNA: bộ khung vector pCAMBIA1301 dài khoảng 12 kb, đoạn gen OsNLI-IF dài 1,3 kb và promoter dài
0,45 kb (đối với pCAM/OsNLI-IF-S) hoặc vùng kết thúc phiên mã dài 0,3 kb (đối với pCAM/ OsNLI-IF-AS) (Hình 3.20A & B, giếng 7).
Hình 3.20: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) Vector
pCAM/OsNLI-IF-S; (B) Vector pCAM/OsNLI-IF-AS. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2: PCR với cặp mồi 35S- Fw/GUS-Rv; giếng 3(A): PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 3(B): PCR với cặp mồi 35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 4: đối chứng âm (khơng có DNA khuôn); giếng 5: cắt giới hạn bằng HindIII; giếng 6: vector nguyên bản; giếng 7: cắt giới hạn bằng EcoRI.
Các nghiên cứu trƣớc đây về nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu yếu tố stress phi sinh học, bao gồm cả hạn hán, sử dụng rất phổ biến các cấu trúc promoter hoạt động mạnh, trong đó đặc biệt là promoter 35S, để chứng minh
chức năng của gen đích trong cây chuyển gen mơ hình [34, 44, 77, 94, 112, 113]. Promoter 35S có nguồn gốc từ virus CaMV (Cauliflower Mosaic Virus), có kích
thƣớc khá nhỏ (vài trăm bp) và hoạt động rất mạnh ở hầu hết tất cả các loại tế bào/mô thực vật, trong mọi giai đoạn phát triển, đặc biệt là ở đối tƣợng cây hai lá mầm. Chính vì vậy, promoter 35S là cấu trúc đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong
nghiên cứu chuyển gen thực vật, chiếm tới hơn 80% số lƣợng thực vật chuyển gen [46, 85]. Ở đây, chúng tôi cũng sử dụng promoter 35S trong thiết kế cấu trúc biểu
hiện gen OsNLI-IF để nghiên cứu chức năng của gen đích trong cây chuyển gen mơ hình (thuốc lá) nhằm chứng minh ảnh hƣởng của nhân tố phiên mã OsNLI-IF đối với khả năng chống chịu stress của cây. Ngồi ra, do OsNLI-IF là gen nội sinh có mặt trong hệ gen của lúa, vì vậy để phục vụ nghiên cứu chức năng OsNLI-IF trong
cây lúa chuyển gen sau này, cấu trúc biểu hiện gen mang trình tự đối mã của gen
OsNLI-IF (anti-sense) cũng đƣợc thiết kế để sử dụng làm đối chứng âm trong thí nghiệm chuyển gen vào lúa, trong đó các phân tử mRNA đối mã có vai trị bất hoạt các gen tƣơng đồng với gen quan tâm có trong cây chuyển gen.