Ghi chú: (A) Trình tự các đoạn DNA đích ngun bản (WT) và đột biến được thay thế trình
tự lõi bằng đoạn poly-A (MU). (B) Biểu hiện của gen chỉ thị trong tế bào nấm men: (i) sơ đồ bố trí thí nghiệm các chủng nấm men mang các cấu trúc khác nhau, (ĐC+): đối chứng dương (chủng nấm men chỉ thị mang đoạn DNA đích JRC2606 và vector pAD/OsRap2.4A), (ĐC-): đối chứng âm (chủng nấm men YM4271 nguyên bản), (JRC0332-WT, JRC0528- WT, JRC0332-MU, JRC0528-MU): chủng nấm men chỉ thị mang đoạn DNA đích nguyên bản (WT) hay đột biến (MU); (ii) môi trường đầy đủ dinh dưỡng YPD; (iii) môi trường
khuyết dưỡng SD/-Leu/-Ura/-His; (iv) mơi trường khuyết dưỡng SD/-Leu/-Ura/-His có 3-
AT 30 mM; (v) hoạt tính biến đổi cơ chất X-Gal của β-galactosidase.
Kết quả nuôi cấy chọn lọc các thể biến nạp thể hiện trong hình 3.10 cho thấy tất cả các chủng nấm men đều có thể sinh trƣởng bình thƣờng trên mơi trƣờng dinh dƣỡng đầy đủ YPD hay mơi trƣờng khuyết dƣỡng SD/-Leu/-Ura/-His (Hình 3.10B – ii & iii). Tuy nhiên, chỉ có tế bào nấm men mang một trong hai đoạn DNA đích nguyên bản JRC0332-WT và JRC0528-WT có thể sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 3-AT giống nhƣ chủng nấm men đối chứng dƣơng (Hình 3.10B – iv). Đối với gen chỉ thị lacZ, chúng tôi cũng thu đƣợc kết quả tƣơng tự: tất cả các chủng nấm men không mang đoạn DNA đích và mang đoạn DNA đích bị đột biến ở vị trí hai motif CCTCCTCC và CTCCAC đều khơng thể hiện hoạt tính β-galactosidase; trong khi hai chủng nấm men mang trình tự DNA ngun bản có
khả năng biến đổi cơ chất X-Gal và tạo màu xanh (Hình 3.10B – v). Các kết quả này chứng tỏ trong tế bào nấm men, protein dung hợp AD-OsNLI-IF đã liên kết đặc hiệu với đoạn DNA chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC nằm trên vùng promoter của hai gen chỉ thị (HIS3 và lacZ) để hoạt hố q trình phiên mã gen.
Đặc điểm đặc trƣng của một nhân tố phiên mã là khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với yếu tố hoạt hoá cis trong vùng promoter của các gen đích. Nhiều yếu tố cis liên quan tới điều hoà hoạt động gen đáp ứng điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Các nhân tố phiên mã thuộc nhóm DREB1 và DREB2 điều hồ sự biểu hiện của các gen cảm ứng điều kiện hạn và lạnh thông qua sự tƣơng tác với yếu tố DRE có chứa trình tự lõi A/GCCGAC [82]. Hai yếu tố cis CRT và LTRE chứa motif bảo thủ CCGAC tƣơng tự yếu tố DRE xuất hiện trong vùng promoter của một số gen đáp ứng stress nhƣ cor15a, kin1, cor6.6
và cor47/rd17 cũng đƣợc nhận biết bởi các nhân tố phiên mã AP2/ERF [52]. Bằng kỹ thuật Y1H, Tran và nhóm nghiên cứu đã xác định đƣợc trình tự lõi CATGTG của đoạn DNA liên kết đặc hiệu với ba nhân tố phiên mã thuộc họ NAC là ANAC019, ANAC055 và ANAC072 [113]. Tƣơng tự, motif CACTAAATTGT CAC cũng đƣợc chứng minh là trình tự lõi của yếu tố cis ZFHDRS liên kết đặc hiệu với nhân tố đáp ứng hạn và mặn ZFHD1 bằng kỹ thuật Y1H [112]. Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã chứng minh đƣợc protein OsNLI-IF có thể nhận biết và liên kết đặc hiệu với hai đoạn DNA đích 50 bp có nguồn gốc từ hai promoter JRC0332 và JRC0528 trong điều kiện in vivo (Hình 3.10). Dựa trên kết quả của thí nghiệm
Y1H sử dụng các đoạn DNA đích bị đột biến, chúng tơi có thể bƣớc đầu kết luận protein OsNLI-IF liên kết đặc hiệu với đoạn DNA có chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC, hoặc ít nhất là một trong hai motif này. Tuy nhiên, những thí nghiệm sâu hơn ở cả điều kiện in vivo và in vitro vẫn cần phải đƣợc tiến hành thêm để phân tích chi tiết hơn đặc điểm liên kết DNA này của protein OsNLI-IF [113].
3.2.3. Hoạt tính hoạt hóa q trình phiên mã của protein OsNLI-IF
Ngoài đặc điểm liên kết DNA đặc hiệu, một protein đƣợc xác định là nhân tố phiên mã cần phải có khả năng điều hịa (hoạt hóa hay ức chế) quá trình phiên mã.
Với mục đích xác định bản thân protein OsNLI-IF có khả năng điều hịa q trình phiên mã hay khơng, ở thí nghiệm này chúng tơi tiếp tục phƣơng pháp Y1H hệ vector YEpGAP để biểu hiện protein OsNLI-IF trong tế bào nấm men chỉ thị.
3.2.3.1. Ghép nối đoạn gen OsNLI-IF vào vector YEpGAP
Để thiết kế vector biểu hiện protein OsNLI-IF trong tế bào nấm men, đoạn gen OsNLI-IF vào vị trí nhận biết của EcoRI/XhoI trên vector YEpGAP.
Vector pGEM/OsNLI-IF đƣợc xử lý với EcoRI/XhoI để giải phóng đoạn DNA
mang trình tự mã hóa của OsNLI-IF (Hình 3.11A, giếng 1). DNA này sau đó đƣợc ghép nối với vector YEpGAP mạch thẳng đã đƣợc xử lý trƣớc đó bằng
EcoRI/XhoI (Hình 3.11A, giếng 3). Hỗn hợp phản ứng ghép nối sử dụng T4 DNA
ligase đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5 . Sử dụng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu của gen, chúng tôi đã chọn đƣợc một số dịng tế bào có mang đoạn gen OsNLI-IF, sản phẩm PCR cho 1 băng DNA duy nhất có kích
thƣớc 1,3 kb trên bản điện di (Hình 3.11B, giếng 1-5).