Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CU & THẢO LUẬN
3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN OsNLI-IF
3.2.4. Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF
Q trình hoạt hố nhân tố phiên mã có thể diễn ra theo nhiều cơ chế khác nhau, ví dụ nhƣ liên kết phối tử hay phosphoryl hoá protein. Tƣơng tác protein- protein là một trong số những yếu tố điều hòa hoạt động chức năng của nhân tố phiên mã. Với mục đích xác định các protein tƣơng tác với OsNLI-IF trong tế bào lúa, chúng tôi thực hiện thí nghiệm sàng lọc thƣ viện cDNA của lúa, sử dụng kỹ thuật Y2H. Trong thí nghiệm này, đoạn gen OsNLI-IF đƣợc ghép nối với trình tự
mã hố domain liên kết DNA BD-GAL4 trên vector biểu hiện pGBKT7 và biến nạp vào nấm men S. cerevisiae AH109 để tạo chủng nấm men chỉ thị. Dựa trên sự biểu hiện của các gen chỉ thị, các dịng cDNA mã hóa protein tƣơng tác với OsNLI-IF sẽ đƣợc sàng lọc từ thƣ viện cDNA xử lý hạn và mặn của lúa.
3.2.4.1. Ghép nối đoạn gen OsNLI-IF vào vector pBD-GAL4
Cấu trúc biểu hiện protein dung hợp BD/OsNLI-IF đƣợc tạo ra bằng cách ghép nối trình tự mã hóa của OsNLI-IF với trình tự mã hóa domain BD trên vector pGBKT7, tại vị trí nhận biết của hai enzyme SalI/NcoI (Phụ lục 1). Hai đoạn DNA 1,3 kb (tƣơng ứng với đoạn gen OsNLI-IF) và 7,3 kb (tƣơng ứng với vector
pGBKT7 mạch thẳng) đƣợc tinh sạch từ sản phẩm phản ứng cắt vector - 7 đồng thời với enzyme SalI/NcoI (Hình 3.14A), sau
đó ghép nối với nhau bằng T4 DNA ligase và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
Thể biến nạp mang đoạn gen đích đƣợc sàng lọc trên mơi trƣờng ni cấy LB có bổ sung Kanamycin (50 µg/ml) và bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc (Hình 3.14B). Một khuẩn lạc dƣơng tính (sản phẩm PCR cho 1 băng DNA kích thƣớc 1,3 kb trên bản điện di) đƣợc chọn ngẫu nhiên để tách chiết plasmid và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen OsNLI-IF bằng phƣơng pháp PCR và cắt enzyme giới hạn.
Hình 3.14: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pGBKT7
Ghi chú: (A) Cắt giới hạn pGEM/OsNLI-IF và pGBKT7 bằng SalI/NcoI và điện di sản
phẩm trên gel agarose 1%; giếng 1 và 2: pGEM/OsNLI-IF; giếng 3 và 4: pGBKT7; giếng 1 và 4: vector nguyên bản; giếng 2 và 3: sản phẩm cắt giới hạn. (B) Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1: đối chứng dương (khuôn là pGEM/OsNLI-IF); giếng 2: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 3 – 11: khuôn là các khuẩn lạc từ 1 – 9. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Hình 3.15: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pGBKT7/OsNLI-IF
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR plasmid
tái tổ hợp; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi T7-Pro/XhoI-NLI-Rv; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 1 và 3: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2 và 4: khuôn là pGBKT7/OsNLI-IF. (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp; giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn bằng HindIII; giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn bằng NdeI; giếng 3: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR với hai cặp mồi T7- Pro/XhoI-NLI-Rv và EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết của các đoạn DNA đƣợc nhân bản, lần lƣợt là 1,4 kb và 1,3 kb trên bản điện di (Hình 3.15A,
giếng 2 và 4). Để khẳng định chắc chắn hơn đoạn gen OsNLI-IF đã đƣợc ghép nối vào vector pGBKT7, plasmid tinh sạch HindIII và NdeI. Enzyme HindIII có ba vị trí nhận biết trên vector pGBKT7; trong khi enzyme NdeI có một
vị trí nhận biết trên vector pGBKT7 và một vị trí nhận biết trên OsNLI-IF (Phụ lục 1 & Phụ lục 8). Kết quả điện di hai sản phẩm phản ứng cắt giới hạn cho thấy các băng DNA thu đƣợc có kích thƣớc lần lƣợt là 1,5 kb, 2,2 kb và 4,9 kb đối với phản ứng cắt bằng HindIII, 0,9 kb và 7,7 kb đối với phản ứng cắt bằng NdeI; các kích
thƣớc này hồn tồn phù hợp với tính tốn, chứng tỏ đoạn gen OsNLI-IF đã đƣợc ghép nối thành cơng vào vector pGBKT7 (Hình 3.15B, giếng 1 và 2).
Vector tái tổ hợp pGBKT7/OsNLI-IF đƣợc biến nạp vào tế bào nấm men S. cerevisiae AH109 để tạo ra chủng nấm men chỉ thị. Thể biến nạp mang vector biểu
hiện sau khi đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng khuyết dƣỡng SD/-Trip và khẳng định lại bằng PCR đƣợc bảo quản ở -80oC để sử dụng cho thí nghiệm Y2H tiếp theo.
3.2.4.2. Sàng lọc protein tương tác OsNLI-IF bằng kỹ thuật Y2H
Thƣ viện xử lý stress hạn và mặn pAD-GAL4/cDNA đƣợc chúng tôi biến nạp vào tế bào nấm men chỉ thị tái tổ hợp mang pGBKT7/OsNLI-IF để sàng lọc dịng cDNA mã hóa protein tƣơng tác với OsNLI-IF. Chủng nấm men S. cerevisiae AH109 sử dụng trong thí nghiệm đã bị gây đột biến bất hoạt các gen
tổng hợp triptophane, leucine, histidine và adenine, đồng thời có mang cấu trúc biểu hiện ba gen chỉ thị HIS3, ADE2 và lacZ đƣợc điều khiển bởi nhân tố phiên mã GAL4. Do đó, chúng tơi sàng lọc thể biến nạp lần lƣợt trên các môi trƣờng
SD/-Trp/-Ura/-His và SD/-Trp/-Ura/-His/-Ade (Bảng 3.3, Phụ lục 10A & B), sau
đó đánh giá hoạt tính phân giải cơ chất X-Gal (Bảng 3.3, Phụ lục 10C) để xác định các dịng khuẩn lạc có biểu hiện đồng thời cả ba gen chỉ thị. Từ 19 dòng khuẩn lạc dƣơng tính, 8 dịng có mang duy nhất một mảnh cDNA kích thƣớc lớn hơn 500 bp đã đƣợc chọn lọc bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi cặp mồi BD-Fw/BD-Rv (Bảng 3.3, Phụ lục 11). Các dòng cDNA này đƣợc nhân dòng vào pGEM-T và giải trình tự gen để định danh. Dựa trên kết quả phân tích trình tự các dịng cDNA thu đƣợc và kết quả so sánh với các trình
tự gen của lúa đã cơng bố trên GenBank, các protein có khả năng tƣơng tác với OsNLI-IF đã đƣợc xác định (Bảng 3.4).
Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress bằng kỹ thuật Y2H.
STT Phƣơng pháp sàng lọc Số dịng cDNA dƣơng tính
1 SD/-Trp/-Ura/-His 62
2 SD/-Trp/-Ura/-His/-Ade 25
3 Hoạt tính β-galactosidase 19
4 PCR 8
*
Mỗi khuẩn lạc nấm men đại diện cho một dịng cDNA dương tính.
Bảng 3.4: Protein tƣơng tác với OsNLI-IF sàng lọc từ thƣ viện cDNA.
Protein tƣơng tác OsNLI-IF Số dòng khuẩn lạc
Polyubiquitin 2
Protein kép chứa domain phosphatase đặc hiệu cho protein 1
Protein liên kết kẽm, thuộc nhóm Alcohol dehydrogenase 1
Protein chƣa đƣợc nghiên cứu 1
Protein liên kết chlorophyll a/b nhóm I, tiền chất của chloroplast 1
Cyclophilin 2 1
Tiểu phần U5 200 kDa của helicase 1
Ở thực vật, quá trình biến đổi protein sau dịch mã có vai trị quan trọng trong việc liên kết các thành phần của mạng lƣới truyền tín hiệu stress phức tạp trong tế bào. Các tƣơng tác protein-protein có thể dẫn tới một số q trình biến đổi protein sau phiên mã, liên quan tới quá trình điều hòa chức năng của nhiều nhân tố phiên mã tham gia vào bộ máy đáp ứng chống chịu yếu tố stress của tế bào [127]. Ví dụ, tƣơng tác giữa các nhân tố phiên mã MYB thuộc nhóm R3-MYB với một số protein bHLH có ý nghĩa quyết định hoạt tính điều hịa phiên mã của nhân tố này [35]. Bằng kỹ thuật Y2H, Lai và nhóm nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính liên kết DNA của nhân tố phiên mã AtWRKY33 đƣợc điều hịa thơng qua tƣơng tác với hai protein SIB1 và SIB2 [67]. Tƣơng tự, trong thí nghiệm này chúng tơi cũng đã xác định đƣợc các protein có khả năng tƣơng tác với nhân tố phiên mã OsNLI-IF bằng thí nghiệm Y2H. Đặc biệt, trong số các dòng cDNA đƣợc phân
lập, có hai dịng mã hóa cho protein ubiquitin, cho thấy có thể q trình ubiquitin hóa là một trong những bƣớc biến đổi sau phiên mã của protein OsNLI-IF. Thực tế, hoạt tính điều hịa phiên mã của nhiều nhân tố phiên mã kiểm soát biểu hiện các gen đáp ứng với điều kiện stress ở thực vật cũng đƣợc điều hịa thơng qua liên kết với protein ubiquitin hay protein SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier protein). Ở A. thaliana, AtMYB18 đƣợc phát hiện xảy ra ubiquitin hóa tại vị trí
các gốc Lysine gần vị trí với domain hoạt hóa phiên mã, qua đó tăng cƣờng hoạt tính hoạt hóa phiên mã của nhân tố phiên mã [35]. Qin và nhóm nghiên cứu đã phân lập đƣợc hai protein liên kết với nhân tố phiên mã DREB2A điều hòa đáp ứng chống chịu hạn ở A. thaliana, đặt tên là DRIP1 và DRIP2, có vai trị trung gian cho quá trình ubiquitin hóa protein DREB2A. Quá trình phiên mã của gen
DREB1/CBF đƣợc phát hiện chịu sự kiểm soát của nhân tố hoạt hóa phiên mã
ICE1 và tính ổn định của protein này đƣợc điều hịa thơng qua q trình ubiquitin hóa bởi protein HOS1 [82].
Hình 3.16: Sơ đồ q trình điều hịa hoạt động chức năng của OsNLI-IF
Ghi chú: Trong điều kiện hạn, mặn, lạnh hay nhiệt độ cao, tế bào thực vật hoạt hố con
đường truyền tín hiệu stress vào nhân tế bào, khởi động quá trình phiên mã và tổng hợp OsNLI-IF. Protein OsNLI-IF trải qua các bước biến đổi sau dịch mã, trở thành nhân tố phiên mã hoàn chỉnh, liên kết với yếu tố cis CCTCCTCC và CTCCAC trong vùng promoter và hoạt hố sự biểu hiện của các gen đích tham gia vào đáp ứng chống chịu stress.
Trong nghiên cứu này, mặc dù chƣa xác định đƣợc cơ chế chính xác cũng nhƣ vai trị của các tƣơng tác giữa OsNLI-IF với trình tự DNA đích và các protein khác trong tế bào thực vật, bằng các thí nghiệm lai phân tử trong tế bào nấm men (Y1H và Y2H), chúng tôi đã chứng minh đƣợc protein OsNLI-IF có đồng thời cả hai hoạt tính liên kết DNA và hoạt hóa phiên mã. Nhân tố phiên mã OsNLI-IF có thể tƣơng tác với các vùng promoter chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC để điều hịa q trình phiên mã của gen đích. Q trình biểu hiện protein OsNLI-IF đã đƣợc chứng minh là cảm ứng với nhiều yếu tố stress khác nhau (hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao, mất nƣớc) và có thể liên quan tới q trình ubiquitin hóa. Từ các kết quả thí nghiệm thu đƣợc, chúng tơi đƣa ra mơ hình hoạt động dự đốn của protein OsNLI-IF nhƣ trong hình 3.16. Tuy nhiên, vai trò của OsNLI-IF đối với đáp ứng chống chịu stress của thực vật vẫn cần phải đƣợc chứng minh bằng các thí nghiệm tiếp theo trên cây chuyển gen.