Ghi chú: Nhân tố phiên mã đáp ứng điều kiện hạn được chia thành hai nhóm phụ thuộc
ABA (màu đỏ) và không phụ thuộc ABA (màu đen). Các nhân tố phiên mã hoạt hoá (mũi tên màu xanh) hoặc ức chế (đường màu đỏ) sự biểu hiện của một số gen đích (ơ màu vàng).
Các TF tham gia trong mạng lƣới điều hòa hoạt động gen đáp ứng stress hạn đã biết cho tới nay đƣợc xác định thuộc hầu hết các nhóm TF lớn của thực vật, trong đó đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là các nhóm AP2/ERF (APETALA 2/ethylene- responsive element binding factor), NAC (NAM/ATAF1/CUC2) và WRKY. Ngoài ra, một số nhân tố phiên mã thuộc các nhóm khác nhƣ MYB/MYC (myeloblastosis oncogene/ myelocytomatosis oncogene), bZIP (basic leucine zipper) hay ZF (C2H2-type zinc finger) cũng đƣợc chứng minh có tham gia vào q trình điều hịa hoạt động gen đáp ứng điều kiện stress hạn ở thực vật [23, 74].
1.3.1. Nhân tố phiên mã AP2/ERF
AP2/ERF là một họ nhân tố phiên mã đặc trƣng của thực vật, với khoảng 145 thành viên ở A. thaliana và 163 thành viên ở lúa. Tất cả các TF thuộc họ AP2/ERF đều có một domain liên kết DNA bảo thủ (AP2/ERF) chứa khoảng 60 gốc acid amin đƣợc gọi là GBD (GCC-box binding domain). Cấu trúc của TF AP2/ERF bao gồm 3 chuỗi xoắn β đối song song ở đầu N (nhận biết trình tự DNA đích) và 1 chuỗi xoắn α ở đầu C. Mỗi nhóm TF AP2/ERF nhận biết và liên kết với một hay một số trình tự DNA đích khác nhau trên vùng promoter của các gen đáp ứng stress tùy thuộc vào các trình tự tín hiệu nằm ở cả đầu N và đầu C của domain liên kết DNA của TF. Họ AP2/ERF đƣợc chia thành 4 phân họ chính, bao gồm AP2, RAV (related to ABI3/VP1), ERF và DREB, trong đó phân họ DREB (với khoảng 56 thành viên) đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Phân họ DREB đƣợc chia thành 6 nhóm nhỏ (từ A1 đến A6) và đã đƣợc xác định có liên quan đặc biệt tới các đáp ứng chống chịu stress môi trƣờng của thực vật nhờ khả năng nhận biết và liên kết với các yếu tố cis nhƣ DRE, CRT, LTRE hay GCC-box có trong trình tự promoter của nhiều gen đáp ứng stress hạn, mặn, lạnh và nóng [74].
Nhóm TF DREB A1 bao gồm 6 thành viên, trong đó DREB1A, DREB1B và DREB1C đƣợc xác định cảm ứng với stress lạnh, DREB1D cảm ứng với điều kiện hạn và ABA, DREB1E và DREB1F đƣợc biểu hiện trong nồng độ muối cao. Một số nghiên cứu đã chứng minh các TF nhóm DREB1 có khả năng tăng cƣờng sức chống chịu hạn của cây lúa chuyển gen. Biểu hiện của DREB1A dƣới sự điều khiển của một promoter cảm ứng stress đã cải thiện đặc tính trổ bơng, giúp tăng sản lƣợng thu hoạch trong điều kiện hạn của dòng lúa chuyển gen so với dịng đối chứng [74]. Nhóm DREB A2 có 8 thành viên, trong đó đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là DREB2A và DREB2B. Cả hai TF này đều đƣợc điều hòa biểu hiện rất mạnh trong điều kiện stress (hạn, mặn và lạnh) theo con đƣờng không phụ thuộc ABA [74]. Cây lúa chuyển gen biểu hiện tăng cƣờng OsDREB2A cũng có tỉ lệ sống sót cao hơn so với cây đối chứng trong điều kiện hạn và mặn. TF thuộc các nhóm DREB khác mặc dù chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều nhƣng cũng đã đƣợc chứng minh có liên quan tới đáp ứng stress và
tăng cƣờng khả năng chống chịu stress cho cây chuyển gen. Ví dụ, biểu hiện của ABI4 (nhóm A3) dẫn tới sự hoạt hóa của hơn 100 gen khác theo con đƣờng phụ thuộc ABA [74]; RAP2.1 (nhóm A5) đƣợc xác định là một nhân tố ức chế phiên mã có vai trị kiểm sốt q trình đáp ứng stress hạn và lạnh [34]; RAP2.4 (nhóm A6) là một nhân tố hoạt hóa q trình phiên mã của các gen đáp ứng stress hạn, ánh sáng và ethylen qua trung gian là yếu tố DRE và ERE (ethylene responsive element) [73].
1.3.2. Nhân tố phiên mã NAC
Protein NAC là một trong những họ TF lớn đặc trƣng của thực vật, với khoảng 110 thành viên ở A. thaliana và 150 thành viên ở lúa [50]. Các TF thuộc họ NAC tham gia vào rất nhiều hoạt động chức năng quan trọng trong quá trình phát triển và đáp ứng stress của thực vật. Nghiên cứu hệ gen của A. thaliana cho thấy toàn bộ các gen NAC đều cảm ứng với ít nhất một loại yếu tố stress phi sinh học,
bao gồm hạn, mặn, lạnh và ABA. Protein NAC chứa domain NAC đặc trƣng đóng vai trò liên kết DNA, bao gồm 168 gốc acid amin tạo thành 1 chuỗi xoắn β kép đối song song và 2 chuỗi xoắn α nằm hai bên. Trình tự bảo thủ WKATQTD nằm trên chuỗi β có vai trị chính quyết định đặc tính lên kết DNA của protein NAC. Protein NAC điều hòa hoạt động promoter của các gen đáp ứng stress nhờ đặc tính liên kết với yếu tố NACBS (NAC-binding site) (5’-TTNCTGA/G-3’) có trình tự lõi đƣợc xác định là CGTG/A [74].
Một số TF NAC thuộc phân nhóm III-3 có tên là ATAF hay SNAC (stress- responsive NAC) đã đƣợc nghiên cứu khá chi tiết. ANAC019, ANAC055 và RD26 là ba thành viên thuộc nhóm này, đã đƣợc chứng minh cảm ứng biểu hiện trong điều kiện hạn, mặn và ABA. Các protein này liên kết với promoter và hoạt hóa sự biểu hiện của một số gen đáp ứng stress hạn (ví dụ nhƣ ERD1), qua đó tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn của cây chuyển gen mơ hình [112]. ATAF1 cũng là một TF có ảnh hƣởng đến khả năng chống chịu hạn của cây A. thaliana. Ngoài ra, các TF của phân nhóm SNAC cũng tham gia vào q trình cảm nhận tín hiệu stress hạn của tế bào thực vật [74].
Gần đây đã có nhiều nghiên cứu chứng minh TF NAC có vai trị tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn của một số loại cây lƣơng thực, đặc biệt là các protein
NAC thuộc phân nhóm III-3. Sự biểu hiện tăng cƣờng trong cây lúa chuyển gen của
SNAC1 giúp tăng khả năng chống chịu hạn, OsNAC6/SNAC2 và OsNAC5 giúp tăng khả năng chịu cả hạn và mặn, OsNAC10 (phân nhóm III-2) và OsNAC45 (phân
nhóm II-3) tăng khả năng chống chịu nhiều yếu tố stress môi trƣờng khác nhau, trong đó có stress hạn. Đặc biệt, vai trị cải thiện tính chịu hạn của SNAC1 và OsNAC10 đã đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm trên quy mô đồng ruộng [44, 45, 51, 86, 109, 130]. Ngoài ra, một vài gen NAC có liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trên các đối tƣợng cây trồng khác nhƣ lúa mì, đậu tƣơng cũng đƣợc nghiên cứu, ví dụ nhƣ TaNAC69, GmNAC20, GmNAC11... [74].
1.3.3. Nhân tố phiên mã WRKY
WRKY cũng là một họ TF lớn, trƣớc đây đƣợc cho là có chức năng điều hịa các đáp ứng chống chịu tác nhân gây bệnh ở thực vật. Gần đây, vai trị của WRKY trong q trình đáp ứng các yếu tố stress phi sinh học nhƣ hạn hán mới đƣợc chứng minh [74]. Đặc điểm chung của các protein WRKY là có domain WRKY chứa 60 gốc acid amin. Cấu trúc của domain WRKY bao gồm 4 hoặc 5 chuỗi xoắn β đối song song và một vị trí liên kết Zn ở đầu N. Chuỗi β mang trình tự bảo thủ WRKYGQK có vai trị chính trong liên kết đặc hiệu DNA của mỗi loại protein WRKY. Nhờ có motif WRKYGQK và các gốc acid amin liên kết Zn, WRKY liên kết đƣợc với yếu tố cis W-box (5’-TTGACC/T-3’) trên vùng promoter để hoạt hóa hay bất hoạt biểu hiện của gen chức năng [37].
Các nhân tố phiên mã WRKY là một thành phần quan trọng của con đƣờng truyền tín hiệu qua trung gian ABA liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn. Ví dụ nhƣ WRKY57 có khả năng liên kết với promoter của gen sinh tổng hợp ABA
NCED3 hay RD29A; WRKY63 liên kết với W-box trong promoter của AREB1/ ABF2; WRKY40 điều hòa hoạt động vùng promoter của một số gen đáp ứng ABA
quan trọng nhƣ ABF4, ABI4, ABI5, DREB1A, MYB2 và RAB18; WRKY18 và
WRKY60 cũng liên quan tới q trình điều hịa hoạt động gen của ABI4, ABI5 [74]. Một số gen mã hóa TF WRKY đã đƣợc chứng minh tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn ở cây lƣơng thực. Ở lúa, sự biểu hiện của OsWRKY11 (đƣợc điều
khiển bởi promoter hoạt động cảm ứng nhiệt HSP101) làm tăng cƣờng tính chịu
hạn và nhiệt độ cao của cây chuyển gen. Tƣơng tự, cây lúa chuyển gen
OsWRKY45 cũng có khả năng chịu hạn và mặn cao hơn cây đối chứng [37, 74]. Hai gen GmWRKY21 và GmWRKY54 khi đƣợc biểu hiện trong cây A. thaliana đã tăng khả năng chịu hạn, mặn và lạnh của cây chuyển gen; trong khi sự biểu hiện của GmWRKY13 lại làm cây chuyển gen tăng tính nhạy cảm với muối, mannitol và giảm tính nhạy cảm với ABA [132].
1.3.4. Một số nhân tố phiên mã khác
Bên cạnh ba nhóm nhân tố phiên mã AP2/ERF, NAC và WRKY, vai trò của một số nhóm nhân tố phiên mã trong đáp ứng điều kiện stress hạn ở thực vật cũng đã đƣợc phát hiện, bao gồm nhóm MYB/MYC, bZIP và ZF.
Các TF thuộc nhóm A của họ bZIP đƣợc xác định đóng vai trị trung tâm của q trình dẫn truyền tín hiệu ABA trong đáp ứng stress của tế bào [74]. Một số yếu tố điều hòa bZIP hiện nay đã đƣợc xác định có tiềm năng áp dụng để tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn của cây trồng. OsABF1, OsbZIP23 và OsbZIP46 (lúa)
đƣợc chứng minh giúp tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn và mặn của cây lúa chuyển gen. SlAREB (cà chua) tƣơng tác với cả promoter RD29B (A. thaliana) và
LAP (cà chua) theo con đƣờng phụ thuộc ABA, qua đó tăng cƣờng khả năng chống
chịu hạn của cây chuyển gen mơ hình. Sự biểu hiện của GmbZIP1 (đậu tƣơng) giúp tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn của cây lúa mì chuyển gen [74].
Zat là nhóm TF thuộc họ C2H2 ZF có liên quan tới đáp ứng stress của A. thaliana đƣợc nghiên cứu khá chi tiết. Zat10/STZ cảm ứng biểu hiện bởi điều kiện
lạnh, liên kết với vùng promoter và ức chế hoạt động của RD29A, làm tăng khả
năng chống chịu các yếu tố stress liên quan đến nhiệt độ và áp suất thẩm thấu. Tƣơng tự, sự tăng cƣờng biểu hiện của TF OsZat10 ở lúa cũng có liên quan tới khả năng chống chịu hạn của cây chuyển gen, góp phần tăng 17 – 36% sản lƣợng trong điều kiện gieo trồng khơng có mƣa. Gần đây, một TF C2H2 ZF ở lúa đƣợc phát hiện có chức năng kiểm sốt độ mở khí khổng trong điều kiện hạn và mặn thông qua cơ chế điều hòa các gen liên quan tới cân bằng H2O2, đƣợc đặt tên là DST
(drought and salt tolerance). Một TF C2H2 ZF khác của lúa là ZFP182 cũng đƣợc chứng minh có vai trị trung gian trong đáp ứng chống chịu hạn, mặn và lạnh [74].
Họ protein MYB/MYC có ở cả động vật và thực vật, tham gia vào rất nhiều quá trình sinh lý khác nhau của tế bào, trong đó có các q trình đáp ứng stress. Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh TF MYB/MYC chỉ đƣợc tổng hợp sau quá trình tích lũy ABA, chứng tỏ vai trị điều hịa đáp ứng stress qua con đƣờng phụ thuộc ABA của MYB/MYC. AtMYB2 và AtMYC2 hoạt hóa q trình phiên mã của gen Rd22
cảm ứng hạn và ABA; AtMYB60 và AtMYB61 tham gia điều hịa q trình đóng mở khí khổng. Tuy nhiên, cho đến nay chỉ có một vài TF MYB/MYC đƣợc nghiên cứu trên đối tƣợng cây lƣơng thực. OsMYB2 và OsMYB3R-2 tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn, mặn và lạnh của cây chuyển gen; trong khi biểu hiện OsMYB4 mặc dù làm tăng khả năng chịu lạnh nhƣng lại gây kiểu hình lùn cho cây chuyển gen. Một số TF MYB/MYC liên quan tới đáp ứng chống chịu stress ở các đối tƣợng khác cũng đƣợc nghiên cứu nhƣ StMYB1R-1 (khoai tây) và TaPIMP1 (lúa mì)... [23, 74].
Một số TF khác có liên quan tới đáp ứng yếu tố stress hạn đã đƣợc một số nhóm nghiên cứu cơng bố gần đây. HRD là một protein thuộc nhóm AP2/ERF IIIc đƣợc phát hiện có liên quan tới cơ chế chống chịu hạn và mặn của A. thaliana [55]. Một protein khác là GRF7 đƣợc xác định bằng kỹ thuật lai phân tử trong nấm men có chức năng ức chế biểu hiện của DREB2A liên quan tới đáp ứng stress hạn [59]. ABI3 cũng là một TF mới đƣợc phát hiện có tham gia vào q trình điều hịa hoạt động của hai promoter cảm ứng điều kiện hạn là RD29A và RD29B [84].
NLI-IF là một họ protein phổ biến ở rất nhiều loài sinh vật nhân chuẩn có chức năng điều hịa q trình phiên mã thơng qua tƣơng tác protein-protein. NLI-IF liên kết với domain LIM của nhiều nhân tố phiên mã thuộc họ LIM để điều hịa q trình phiên mã của gen đích. Trong phức hệ phiên mã, NLI-IF hoạt động nhƣ một enzyme khử phosphoryl hóa domain phía đầu C của tiểu đơn vị lớn nhất của RNA polymerase II để tái sử dụng enzyme này cho một vòng phiên mã mới. Ngồi ra, NLI-IF cũng có thể điều hịa một số hoạt động chức năng khác của RNA polymerase II liên quan tới hoạt tính polymerase và các quá trình nhƣ gắn mũ G,
kéo dài chuỗi, cắt/nối luân phiên, gắn đuôi poly-A. Một số nghiên cứu đã chứng minh hoạt động của NLI-IF có liên quan tới q trình đáp ứng stress ở nấm men hay điều hịa q trình phát triển của động vật đa bào nhƣ quá trình phát triển thần kinh của động vật có vú, phát triển phơi của sâu bọ… [22, 54, 103]. Tuy nhiên, cho đến nay chƣa có một nghiên cứu nào đề cập tới vai trị điều hịa q trình phiên mã của NLI-IF trong đáp ứng chống chịu hạn của tế bào thực vật.
1.4. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT
1.4.1. Nghiên cứu chuyển gen vào lúa
Lúa là đối tƣợng cây trồng đƣợc quan tâm nghiên cứu từ rất sớm và hƣớng nghiên cứu chuyển gen vào lúa đã có những thành cơng quan trọng từ cuối những năm 1980. Các nhà nghiên cứu đã phát triển phƣơng pháp chuyển gen lúa sử dụng xung điện và polyethylene glycol (PEG) vào năm 1988, năm 1991 đã chuyển đƣợc gen vào lúa bằng súng bắn gen và đến năm 1993 đã thành công trong việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen vào lúa Oryza sativa L. ssp.
japonica. Mặc dù phƣơng pháp chuyển gen sử dụng A. tumefaciens sau đó đã đƣợc
cải tiến rất nhiều nhƣng vấn đề chuyển gen vào giống lúa nhóm Indica vẫn là một thách thức lớn với các nhà nghiên cứu. Năm 2008, Hiei và Komari đã
phát triển một phƣơng pháp chuyển gen vào lúa Indica bằng cách sử dụng phôi non và thu đƣợc hiệu quả rất cao (5 – 13 thể biến nạp/phôi non). Tuy nhiên, nhƣợc điểm lớn nhất của phƣơng pháp này đó là khó thu thập đƣợc phơi non [24].
Với những thành công trong nghiên cứu quy trình chuyển gen vào lúa, hiện nay các nhà khoa học có thể dễ dàng chuyển một gen ngoại lai vào một giống lúa bất kỳ. Tuy nhiên, để phục vụ cho các mục đích nghiên cứu khác nhau, một số kỹ thuật chuyển gen lúa cải tiến đã đƣợc phát triển, ví dụ nhƣ chuyển đa gen, biểu hiện gen đặc hiệu mô/cảm ứng điều kiện môi trƣờng và chuyển gen vào lục lạp [24].
1.4.1.1. đa gen
đa gen là phƣơng pháp chuyển đồng thời nhiều gen ngoại lai vào cùng một đối tƣợng giống lúa. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng khi cần chuyển nhiều gen
tiềm năng một lúc để nghiên cứu đánh giá chức năng. Khi đó, việc chuyển đồng thời nhiều gen bằng một cấu trúc Ti-plasmid duy nhất với một lần thực hiện thao tác gen có ý nghĩa rất lớn, giúp tiết kiệm rất nhiều thời gian, công sức và chi phí. Hiện nay các giống cây lƣơng thực chuyển gen thƣơng mại đều đƣợc chuyển một gen đơn lẻ để kiểm sốt tính trạng chất lƣợng, ví dụ nhƣ kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ hay kháng bệnh. Tuy nhiên, có rất nhiều tính trạng đƣợc quy định bởi hai hay nhiều gen. Chính vì vậy, để kiểm sốt đƣợc các tính trạng đa gen thì phải chuyển đồng thời nhiều gen vào cùng một đối tƣợng. Bên cạnh đó, phƣơng pháp này cũng cần thiết trong trƣờng hợp cần tạo ra một con đƣờng trao đổi chất mới với nhiều gen tham gia. Ví dụ nhƣ giống lúa có hạt gạo màu vàng đƣợc tạo ra nhờ chuyển hai gen ngoại lai để thiết lập một con đƣờng sinh tổng hợp β-carotenoid mới [24, 125].
Có hai phƣơng thức để đa gen vào thực vật. Cách thứ nhất là thiết kế nhiều vector nhị phân, mỗi vector mang một gen đích. Các cấu trúc mang gen sau