Tên dòng Số hạt kiểm tra Số hạt nảy mầm trên Hygromycin
Tỉ lệ cây có kết quả PCR dƣơng tính Mồi Actin Mồi Hygromycin Mồi OsNLI-IF
L1 10 7 7/7 7/7 7/7 L2 10 5 5/5 5/5 5/5 L3 10 8 8/8 6/8 6/8 L4 7 3 3/3 3/3 3/3 L5 10 9 9/9 7/9 7/9 L6 10 4 4/4 3/4 3/4 L7 10 7 7/7 7/7 7/7 L8 10 7 7/7 6/7 6/7 L9 10 5 5/5 5/5 5/5 L10 10 5 5/5 5/5 5/5 L11 8 6 6/6 4/6 4/6 L12 10 3 3/3 3/3 3/3 L13 10 8 8/8 7/8 7/8 L14 10 8 8/8 8/8 8/8 L15 4 3 3/3 3/3 3/3 L16 10 7 7/7 7/7 7/7
Sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen đích trong các cây lúa chuyển gen T1 đƣợc phát hiện bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho cấu trúc Ubi:OsNLI-IF. Kết quả thu đƣợc cho thấy 100% các mẫu DNA tách chiết đều cho kết quả PCR dƣơng
tính với cặp mồi Actin-Fw/Actin-Rv, chứng tỏ chất lƣợng DNA tách chiết hồn tồn đạt u cầu cho thí nghiệm (Bảng 3.10). Các phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của vector pBI101 (Hyg-Fw/Hyg-Rv) và cặp mồi đặc hiệu của cấu trúc
Ubi:OsNLI-IF (NLI-t-Fw/NOS-Rv) cho kết quả tƣơng tự nhau với 86 mẫu dƣơng
tính và 9 mẫu âm tính. Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã thu đƣợc các cây lúa chuyển gen T1 có mang cấu trúc Ubi:OsNLI-IF trong hệ gen.
3.4.3.3. Phân tích mức độ biểu hiện gen OsNLI-IF của các dòng lúa T1
Mặc dù đã xác định đƣợc sự có mặt của cấu trúc Ubi:OsNLI-IF trong cây lúa chuyển gen T1, sự biểu hiện của OsNLI-IF còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố nhƣ số lƣợng bản sao của gen đích, vị trí của cấu trúc biểu hiện gen trong hệ gen, sự tƣơng tác với các yếu tố điều hịa trong nhân... [19]. Trong thí nghiệm phân tích mức biểu hiện của gen chuyển OsNLI-IF trong các dòng lúa chuyển gen, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Real-time PCR với cặp mồi đặc hiệu NLI-t-Fw/NOS-Rv nhằm phát hiện mức độ tích luỹ mRNA OsNLI-IF trong mơ của cây lúa chuyển gen T1. RNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá của các cây lúa chuyển gen kháng Hygromycin có kết quả kiểm tra PCR dƣơng tính ở giai đoạn 3 lá non để sử dụng làm khuôn cho các phản ứng RT- PCR. Mẫu RNA tổng số tách chiết từ cây lúa không chuyển gen đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng; gen actin đƣợc sử dụng làm gen nội chuẩn. Mức độ biểu hiện của gen
OsNLI-IF trong cây chuyển gen đƣợc so sánh với cây lúa đối chứng không chuyển gen thông qua kết quả giá trị Ct thu đƣợc từ thí nghiệm Real-time PCR.
Kết quả so sánh mức độ biểu hiện gen cho thấy dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động liên tục Ubiquitin, gen đích OsNLI-IF đã biểu hiện ở tất cả 16
dòng lúa chuyển gen đƣợc kiểm tra, thể hiện ở hàm lƣợng mRNA OsNLI-IF trong
cây chuyển gen cao hơn rõ rệt so với cây lúa đối chứng không chuyển gen. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của gen chuyển giữa các dịng lúa chuyển gen có sự khác biệt rất lớn và đƣợc chia thành 3 nhóm. Nhóm thứ nhất biểu hiện gen OsNLI-IF yếu (mức độ biểu hiện gấp 1 – 10 lần so với cây đối chứng), bao gồm các dòng L1, L3, L5, L6, L7, L8, L10, L11. Nhóm thứ hai là các dịng cây chuyển gen biểu hiện gen đích ở mức vừa phải (mức độ biểu hiện gấp 10 – 20 lần so với cây đối chứng), bao
gồm dòng L4, L9, L 13 và L16. Các dòng L2, L12, L14 và L15 thuộc nhóm biểu hiện gen chuyển OsNLI-IF ở mức độ mạnh (gấp >20 lần dòng lúa khơng chuyển
gen), trong đó đặc biệt hai dịng L12 và L15 có gen đích biểu hiện cao hơn dịng đối chứng xấp xỉ 40 lần (Hình 3.34). Kết quả so sánh mức độ biểu hiện tƣơng quan của
OsNLI-IF giữa các dòng lúa chuyển gen với dịng lúa đối chứng khơng chuyển gen
chứng tỏ chúng tôi đã chuyển thành công cấu trúc Ubi:OsNLI-IF vào giống lúa
Indica và đã thu đƣợc các dịng có biểu hiện gen chuyển OsNLI-IF.
Hình 3.34: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các cây lúa chuyển gen T1
Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen T1 (L 1 –L16) được
xác định dựa trên hàm lượng mRNA OsNLI-IF tương quan giữa các dòng lúa chuyển gen với dịng lúa khơng chuyển gen đối chứng (WT). Mức độ biểu hiện gen của cây lúa khơng chuyển gen có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm.
Trong nhiều nghiên cứu trƣớc đây, thí nghiệm phân tích cây chuyển gen thƣờng đƣợc thực hiện với các cây đồng hợp tử từ thế hệ T2 trở đi để xác định chính xác sự biểu hiện của gen chuyển nhằm tìm hiểu cơ chế điều hòa hoạt động gen của nhân tố phiên mã đƣợc nghiên cứu [44, 73, 86, 112, 113]. Tuy nhiên, với mục đích chứng minh mối liên hệ giữa sự biểu hiện của gen mã hóa nhân tố phiên mã với sự xuất hiện tính trạng mới của cây chuyển gen, một số nghiên cứu đã phân tích cây chuyển gen ở ngay thế hệ T0 hay T1. Ví dụ, khi nghiên cứu chức năng của gen OsMAPK2, Hur và nhóm nghiên cứu đã phân tích biểu hiện của gen chuyển trong các dòng A. thaliana chuyển gen T1 bằng phƣơng pháp lai RNA [47]. Biểu hiện của gen OsNAC6 dƣới sự điều khiển của promoter 35S trong các
dòng lúa chuyển gen cũng đƣợc Rachmat và nhóm nghiên cứu chứng minh bằng kỹ thuật Real-time PCR ở thế hệ cây chuyển gen T1 [97]. Bên cạnh nguyên nhân mỗi dòng cây chuyển gen là một sự kiện chuyển gen độc lập, mức độ biểu hiện gen đích khác nhau giữa các cây lúa chuyển gen trong các nghiên cứu này phản ánh sự không đồng nhất về mặt di truyền giữa các cây lúa T1. Trong nghiên cứu của chúng tôi, mức độ biểu hiện gen đích của 16 dòng lúa chuyển gen T1 khác nhau đã đƣợc xác định dựa trên kết quả phân tích hàm lƣợng mRNA bằng kỹ thuật Real-time PCR. Tất cả các dòng lúa biểu hiện gen OsNLI-IF này sẽ đƣợc phân tích khả năng chống chịu hạn để chứng minh vai trò chức năng của nhân tố phiên mã OsNLI-IF trong cây lúa.
3.4.3.4. Đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây lúa chuyển gen T1
Trong thí nghiệm chuyển gen OsNLI-IF vào thuốc lá, sự biểu hiện của gen
chuyển dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động liên tục 35S đã tăng cƣờng đáng kể khả năng chống chịu hạn của cây chuyển gen. Để khẳng định vai trò của nhân tố phiên mã OsNLI-IF, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen Ubi:OsNLI-IF. Các cây lúa chuyển gen T1 kháng Hygromycin ở giai đoạn 3 lá non sau khi đã kiểm tra sự biểu hiện của gen đích bằng RT-PCR đƣợc chuyển sang trồng trong điều kiện hạn giả định (không tƣới nƣớc) và so sánh khả năng phục hồi sau stress hạn với cây lúa đối chứng không chuyển gen.
Trong thí nghiệm khơng xử lý stress hạn, các cây lúa chuyển gen T1 sinh trƣởng bình thƣờng và khơng thể hiện đặc điểm hình thái khác biệt rõ rệt nào so với cây không chuyển gen ở giai đoạn 3 lá non (Hình 3.35). Mặc dù số lƣợng mẫu thí nghiệm ít (chƣa đủ cho phân tích thống kê) do hạn chế về số lƣợng hạt thu đƣợc từ cây chuyển gen T0, quan sát ban đầu cho thấy trong cùng một điều kiện gieo trồng, thời gian phát triển từ hạt tới giai đoạn cây 3 lá non của các dòng lúa chuyển gen cần ~ 4 tuần, chậm hơn so với thời gian 3 tuần của cây không chuyển gen (số liệu khơng trình bày). Kết quả thu đƣợc này hồn tồn phù hợp với kết quả thí nghiệm đánh giá sinh trƣởng của cây thuốc lá mang cấu trúc biểu hiện OsNLI-IF đã trình bày ở trên.
Hình 3.35: Hình thái của cây lúa chuyển gen T1 giai đoạn 3 lá non
Ghi chú: Cây lúa không chuyển gen (WT) sau 3 tuần gieo hạt và các dòng lúa chuyển gen
T1 (L1 – L16) sau 4 – 5 tuần gieo hạt được so sánh hình thái với nhau. Ở giai đoạn 3 lá non, các dịng lúa khơng biểu hiện sự khác biệt về hình thái sinh trưởng.
Kết quả đánh giá khả năng chống chịu hạn trình bày trong bảng 3.11 và hình 3.36 cho thấy tất cả các dòng lúa chuyển gen mang cấu trúc Ubi:OsNLI-IF đƣợc kiểm tra đều thể hiện tính chịu hạn tốt hơn so với dòng đối chứng không chuyển gen. Trong thí nghiệm xử lý stress hạn bằng cách ngừng tƣới nƣớc trong hai tuần liên tục, mặc dù các cây lúa chuyển gen có những biểu hiện khơ héo tƣơng tự nhƣ cây lúa không chuyển gen, tất cả các cây lúa chuyển gen đều phục hồi và sinh trƣởng trở lại sau ba ngày đƣợc tƣới nƣớc liên tục (Hình 3.36A, dịng L1, L4, L6-8, L12-14). Trong khi đó, chỉ có duy nhất dịng lúa đối chứng không đƣợc chuyển gen
OsNLI-IF không thể phục hồi sinh trƣởng và bị chết (Hình 3.36A, dịng WT). Đặc
biệt, các cây lúa có gen OsNLI-IF biểu hiện ở mức độ thấp (L1, L6 và L7) lại có tốc độ phục hồi nhanh hơn so với các cây lúa có gen đích biểu hiện ở mức trung bình (L4, L8 và L13) và mức cao (L12 và L14). Trong thí nghiệm xử lý stress hạn bằng cách ngừng tƣới nƣớc ba tuần liên tục đối với ba dòng lúa chuyển gen đại diện cho ba nhóm biểu hiện gen OsNLI-IF ở các mức độ khác nhau (L1 – biểu hiện gen yếu, L13 – biểu hiện gen trung bình, L14 – biểu hiện gen mạnh), chỉ có duy nhất dịng L1 phục hồi và sinh trƣởng trở lại sau stress. Cả hai dòng L13 và L14 đều bị chết tƣơng tự dịng lúa đối chứng khơng chuyển gen (Hình 3.36B, Bảng 3.11). Kết quả thu đƣợc này, cùng với kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá
biểu hiện gen OsNLI-IF chứng tỏ sự biểu hiện liên tục của gen OsNLI-IF dƣới sự
điều khiển của một promoter hoạt động mạnh (35S hay Ubiquitin) có thể tăng
cƣờng khả năng chịu hạn của các dòng cây chuyển gen và mức độ chống chịu hạn của các dòng cây chuyển gen tỉ lệ nghịch với mức độ biểu hiện của gen đích.
Hình 3.36: Khả năng phục hồi sau xử lý stress hạn của cây lúa chuyển gen T1
Ghi chú: Cây lúa non 3 lá non được trồng trong điều kiện không tưới nước liên tục 2 tuần (A) và 3 tuần (B), sau đó được tưới nước trở lại trong 3 ngày. (WT) cây lúa không chuyển
gen; (L1, L6, L7) dòng lúa T1 biểu hiện OsNLI-IF ở mức thấp; (L4, L8, L13) dòng lúa T1 biểu hiện OsNLI-IF ở mức trung bình; (L12, L14) dịng lúa T1 biểu hiện OsNLI-IF ở mức cao. Hình trái: minh hoạ vị trí sắp xếp các dịng lúa thí nghiệm; hình phải: ảnh chụp cây lúa sau 3 ngày tưới nước phục hồi.
Trong các công bố về nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn trƣớc đây, các tác giả sử dụng rất nhiều phƣơng pháp thí nghiệm khác nhau để đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây chuyển gen [34, 45, 51]. Tuy nhiên, đánh giá nhanh khả năng chống chịu hạn của cây dựa trên số lƣợng cây sống sót sau giai đoạn tiếp xúc với điều kiện stress hạn giả định ụng trong hầu hết các nghiên cứu. Cây chuyển gen đƣợc xử lý stress hạn bằng cách ngừng tƣới nƣớc một thời gian, sau đó tƣới nƣớc trở lại và so sánh khả năng phục
hồi sau giai đoạn stress hạn với cây đối chứng (không chuyển gen hoặc đƣợc chuyển cấu trúc khơng mang gen đích). Tran và nhóm nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp này để đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng A. thaliana đƣợc
chuyển cấu trúc 35S:ANAC019, 35S:ANAC055 và 35S:ANAC072 [113]. Tƣơng tự,
Liu và nhóm nghiên cứu đã chứng minh khả năng chống chịu hạn và lạnh của cây
A. thaliana biểu hiện gen DREB1A dựa trên số lƣợng cây chuyển gen phục hồi sau
stress [77]. Khả năng chống chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen DREB1 và
OsDREB1 cũng đƣợc chứng minh dựa trên tỉ lệ sống sót của cây lúa sau khi xử lý
stress trong nghiên cứu của Ito và nhóm nghiên cứu [85]. Bằng phƣơng pháp ngừng tƣới nƣớc để tạo ra môi trƣờng khô hạn giả định, các dòng lúa chuyển gen
Ubi:OsNLI-IF bƣớc đầu đã đƣợc chứng minh có dấu hiệu chống chịu hạn cao hơn
so với cây lúa không chuyển gen.