Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CU & THẢO LUẬN
3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN OsNLI-IF
3.2.1. Biểu hiện của gen OsNLI-IF trong các điều kiện stress phi sinh học
Dựa trên kết quả thí nghiệm sàng lọc gen bằng kỹ thuật Y1H, protein OsNLI-IF đƣợc dự đốn có khả năng tƣơng tác với trình tự đích nằm trong vùng promoter của hai gen JRC0332 và JRC0528 đƣợc hoạt hóa biểu hiện bởi yếu tố stress lạnh, mặn và hormone ABA [96]. Để xác định mơ hình biểu hiện của gen
OsNLI-IF trong các điều kiện stress phi sinh học, cây lúa non ba tuần tuổi xử lý với
ngâm rễ trong dung dịch PEG 20% (hạn) và NaCl 200 mM (mặn), giữ trong điều kiện nhiệt độ 4oC (lạnh) và 42oC (nhiệt độ cao), ngâm trong dung dịch ABA 100 µM (đáp ứng hormone). RNA tổng số của các mẫu lúa đã xử lý stress trong khoảng thời gian khác nhau đƣợc tách chiết và sử dụng cho các thí nghiệm phân tích hàm lƣợng mRNA của gen OsNLI-IF bằng kỹ thuật Real-time PCR. Mẫu RNA tách chiết từ cây lúa ở thời điểm chƣa xử lý stress đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng âm. Trong thí nghiệm này, gen actin đƣợc sử dụng làm gen nội chuẩn để so sánh tƣơng quan giữa các mẫu phân tích (Hình 3.7).
Kết quả phân tích hàm lƣợng mRNA bằng Real-time PCR cho thấy gen
OsNLI-IF hầu nhƣ khơng có sự thay đổi mức đổi biểu hiện trong mô thân và lá trong
suốt giai đoạn xử lý cây với các điều kiện stress giả định khác nhau (Hình 3.7). Ngƣợc lại, trong mô rễ, số lƣợng bản sao mRNA của OsNLI-IF thay đổi rõ rệt theo
thời gian trong thí nghiệm xử lý stress. Mức độ biểu hiện cao nhất của OsNLI-IF
quan sát đƣợc ở thời điểm 12 giờ trong thí nghiệm xử lý stress mặn, thể hiện ở hàm lƣợng mRNA tăng khoảng 68 lần so với bình thƣờng. Hàm lƣợng mRNA của OsNLI-
IF tăng đáng kể trong vòng 2 giờ sau khi tiếp xúc với stress lạnh và mặn (tăng khoảng
20 lần), đạt đỉnh sau 6 – 12 giờ xử lý stress. Trong thí nghiệm xử lý điều kiện mất nƣớc, mức độ phiên mã của OsNLI-IF tăng chậm hơn nhƣng đạt đỉnh khá sớm ở thời điểm 2 giờ (tăng ~30 lần), sau đó bắt đầu giảm dần. Đối với thí nghiệm xử nhiệt độ 42oC, chúng tơi phát hiện hàm lƣợng mRNA của OsNLI-IF thay đổi rất nhanh, tăng hơn 40 lần chỉ trong thời gian 30 phút, sau đó bắt đầu giảm dần. Tuy nhiên, đến thời điểm 6 giờ sau khi xử lý stress, OsNLI-IF dƣờng nhƣ tăng biểu hiện trở lại và đạt gần tới mức biểu hiện cao nhất (thời điểm 0,5 giờ) sau 12 giờ. Mức độ tích lũy mRNA của OsNLI-IF trong điều kiện hạn và lạnh xảy ra chậm hơn so với trong điều kiện stress nhiệt độ cao và đều đạt đỉnh ở thời điểm 6 giờ sau khi xử lý stress. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của OsNLI-IF trong điều kiện stress hạn giảm rất nhanh về gần mức cơ bản sau 12 giờ xử lý stress. Ngƣợc lại, trong các thí nghiệm xử lý stress lạnh, mất nƣớc và đặc biệt là stress mặn, OsNLI-IF vẫn duy trì mức độ biểu hiện cao sau 24 giờ tiếp xúc với yếu tố stress. Đối với thí nghiệm xử lý cây lúa non bằng hormone ABA,
chúng tôi không phát hiện đƣợc sự thay đổi đáng kể nào về hàm lƣợng mRNA trong hầu hết thời gian thí nghiệm. Các kết quả thu đƣợc này chứng tỏ quá trình phiên mã của OsNLI-IF đƣợc điều hòa bởi nhiều yếu tố stress phi sinh học khác nhau, bao gồm stress mặn, hạn, mất nƣớc, lạnh và nhiệt độ cao.
.
Hình 3.7: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện môi trƣờng bất lợi
Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen OsNLI-IF trong cây lúa đã xử lý stress để khơ trong khơng
khí (mất nước), hạn (PEG 20%), mặn (NaCl 200 mM), lạnh (4oC), nóng (42oC) và hormone (ABA 100 µM) trong thời gian 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ được xác định bằng Real-time PCR, sử dụng khuôn là RNA tách chiết từ mô thân/lá (cột màu đỏ) và mơ rễ (cột màu tím). Mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử lý stress (0 h) có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm.
Trong hơn hai thập kỉ qua, đã có rất nhiều nghiên cứu chi tiết về mơ hình biểu hiện của các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu
yếu tố stress phi sinh học ở thực vật đã đƣợc thực hiện. Kết quả thu đƣợc từ các nghiên cứu đã cho thấy mô hình biểu hiện của các gen này rất đa dạng và khơng phụ thuộc vào lồi thực vật hay cấu trúc cũng nhƣ chức năng của sản phẩm protein [14, 93]. Nhiều nhân tố phiên mã đƣợc xếp vào cùng một họ và một nhóm dựa theo sự tƣơng đồng về cấu trúc nhƣng đáp ứng với các yếu tố stress khác nhau trong các đối tƣợng thực vật khác nhau [82]; ví dụ nhƣ ZmDBF1 (ngơ) biểu hiện đáp ứng với stress mất nƣớc và mặn [61], AhDREB1 (Atriplex hortensis) tham gia vào con đƣờng đáp ứng hạn và mặn [104], GmDREBb (đậu tƣơng) phiên mã mạnh trong
điều kiện stress lạnh, hạn và mặn [72], AtRap2.4 (A. thaliana) đƣợc tăng cƣờng biểu hiện bởi yếu tố stress hạn và mặn, nhƣng giảm trong điều kiện stress ánh sáng [73]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra sự biểu hiện của gen OsNLI-IF ở
lúa đƣợc tăng cƣờng bởi hầu hết tất cả yếu tố stress phi sinh học, bao gồm cả mặn, hạn, mất nƣớc, lạnh và nhiệt độ cao (Hình 3.7), chứng tỏ OsNLI-IF có thể là một protein có nhiều chức năng quan trọng tham gia vào hệ thống đáp ứng điều kiện ngoại cảnh bất lợi của tế bào thực vật, trong đó có điều kiện khơ hạn.
Bên cạnh đặc điểm biểu hiện cảm ứng điều kiện stress, nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã điều hòa biểu hiện của các gen đáp ứng điều kiện stress còn biểu hiện đặc hiệu mô và biểu hiện tƣơng quan với thời gian tiếp xúc yếu tố stress.
AhDREB1 đƣợc điều hòa bởi yếu tố stress mặn nhƣng chỉ biểu hiện ở mô rễ; OsDREB1F đƣợc biểu hiện liên tục trong hầu hết các mô và cơ quan khác nhau
nhƣ lá non, rễ non, lá trƣởng thành, rễ trƣởng thành và mô sẹo; GmDREBa và GmDREBb cũng đƣợc biểu hiện trong lá cây đậu tƣơng dƣới điều kiện hạn, mặn
và lạnh, trong khi GmDREBc chỉ biểu hiện ở rễ trong điều kiện hạn, mặn và ABA [23]. Dựa trên kết quả phân tích bằng Real-time PCR (Hình 3.7), gen OsNLI-IF
bƣớc đầu đƣợc xác định biểu hiện đặc hiệu trong mô rễ của cây lúa non dƣới các điều kiện stress phi sinh học liên quan tới áp suất thẩm thấu và nhiệt độ.
Nhiều tác giả khi nghiên cứu về cơ chế chống chịu yếu tố stress phi sinh học của thực vật đã đƣa ra kết luận trong tế bào tồn tại ít nhất hai con đƣờng điều hoà hoạt động gen cơ bản đáp ứng với yếu tố stress: (i) con đƣờng điều hoà phụ
thuộc ABA và (ii) con đƣờng điều hịa khơng phụ thuộc ABA [74, 82]. Sự biểu hiện của đa số các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu yếu tố stress phi sinh học thuộc họ bZIP và MYB đƣợc điều hịa theo con đƣờng phụ thuộc tín hiệu ABA, trong khi nhiều gen thuộc phân họ DREB đã đƣợc chứng minh cảm ứng biểu hiện theo con đƣờng điều hịa khơng phụ thuộc tín hiệu ABA [52]. Ngồi ra, các thành viên của một số họ gen khác nhƣ NAC, WRKY và ZF
đƣợc xác định có liên quan tới cả hai con đƣờng điều hịa hoạt động gen phụ thuộc và khơng phụ thuộc tín hiệu ABA [74]. Bằng kỹ thuật Real-time PCR chúng tôi đã chứng minh OsNLI-IF đƣợc cảm ứng biểu hiện bởi nhiều yếu tố stress phi sinh
học khác nhau theo con đƣờng khơng phụ thuộc vào tín hiệu ABA (Hình 3.7).
3.2.2. Hoạt tính liên kết đặc hiệu với đoạn DNA đích của protein OsNLI-IF
Một protein đóng vai trị là một nhân tố phiên mã trong tế bào phải có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hay một vài trình tự DNA nhất định. Trong thí nghiệm sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA, gen OsNLI-IF đã đƣợc phân lập trong cả
hai thí nghiệm sàng lọc gen sử dụng hai đoạn DNA đích khác nhau (JRC0332 và JRC0528) có kích thƣớc 50 bp mang hai motif CCTCCTCC và CTCCAC; kết quả này cho thấy protein OsNLI-IF có thể nhận biết đƣợc đồng thời cả hai đoạn DNA đích này. Để chứng minh cho giả thuyết này, chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật Y1H, trong đó trình tự DNA mã hố protein OsNLI-IF đƣợc ghép nối với trình tự mã hố domain hoạt hoá phiên mã AD-GAL4 trên vector biểu hiện pAD-GAL4 để biểu hiện protein dung hợp trong tế bào nấm men. Khi đó, OsNLI-IF sẽ đóng vai trị là domain (vùng chức năng) liên kết DNA để tƣơng tác với promoter của hai gen
HIS3 và lacZ trên vector chỉ thị pHISi và pLacZi và hoạt hố q trình phiên mã.
3.2.2.1. Ghép nối đoạn gen OsNLI-IF vào vector pAD-GAL4
Đoạn gen OsNLI-IF trên vector pGEM/OsNLI-IF đƣợc ghép nối vào vị trí nhận biết của EcoRI/XhoI trên vector pAD-GAL4 (Phụ lục 1). Hai đoạn DNA kích thƣớc 1,3 kb (tƣơng ứng với đoạn gen OsNLI-IF) và 7,7 kb (tƣơng ứng với vector
pAD-GAL4 mạch thẳng) thu đƣợc từ sản phẩm cắt giới hạn vector pGEM/OsNLI- IF và pAD-GAL4 đƣợc tinh sạch, ghép nối và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
Các thể biến nạp xuất hiện trên môi trƣờng chọn lọc sàng lọc bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu của gen đích. Kết quả thu đƣợc cho thấy một số khuẩn lạc có mang đoạn gen OsNLI-IF, sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc này khi
đƣợc điện di trên gel agarose 1% cho 1 băng DNA duy nhất có kích thƣớc 1,3 kb (Hình 3.8B, giếng 1, 3 và 4) tƣơng tự nhƣ phản ứng đối chứng dƣơng sử dụng vector pGEM/OsNLI-IF làm khn (Hình 3.8B, giếng 7).
Hình 3.8: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pAD-GAL4
Ghi chú: (A) Cắt giới hạn pGEM/OsNLI-IF và pAD-GAL4 bằng EcoRI/XhoI và điện di
sản phẩm trên gel agarose 1%; giếng 1 và 2: pAD-GAL4; giếng 3 và 4: pGEM/OsNLI- IF; giếng 1 và 3: vector nguyên bản; giếng 2 và 4: sản phẩm cắt giới hạn. (B) Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1 – 5: khuôn là các khuẩn lạc từ 1 – 5; giếng 6: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 7: đối chứng dương (khuôn là pGEM/OsNLI-IF). Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Thể biến nạp có kết quả PCR dƣơng tính đƣợc ni cấy, tách chiết plasmid và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích trong plasmid tái tổ hợp bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới hạn. Đối với PCR kiểm tra plasmid tinh chiết bằng cặp mồi EcoRI- NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv đặc hiệu cho OsNLI-IF và cặp mồi đặc hiệu AD-Fw/AD-Rv cho vector pAD-GAL4, sản phẩm PCR khi đƣợc điện di trên gel agarose cho 2 băng DNA có kích thƣớc lần lƣợt là 1,3 và 1,5 kb (Hình 3.9A, giếng 1 và 3). Khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI/XhoI, kết quả điện di cho 2 băng
DNA có kích thƣớc 1,3 và 7,7 kb (Hình 3.9B, giếng 1). Kích thƣớc của các băng DNA thu đƣợc này hồn tồn phù hợp với kích thƣớc theo tính tốn lý thuyết, chứng tỏ chúng tơi đã thu đƣợc plasmid tái tổ hợp pAD-GAL4 có mang khung đọc mở của gen OsNLI-IF (pAD/OsNLI-IF).
Hình 3.9: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pAD/OsNLI-IF
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
plasmid tái tổ hợp; giếng 1 và 3: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2 và 4: PCR với cặp mồi AD-Fw/AD-Rv; giếng 1 và 2: khuôn là pAD/OsNLI-IF; giếng 3 và 4: đối chứng âm (khơng có DNA khuôn). (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng
EcoRI/XhoI; giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
3.2.2.2. Đánh giá khả năng tương tác với đoạn DNA đích của OsNLI-IF
Để xác định khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF, vector biểu hiện pAD/OsNLI-IF đƣợc biến nạp vào chủng nấm men S. cerevisiae YM4271 mang cấu trúc biểu hiện gen chỉ thị pHISi/JRC0332 và pLacZi/JRC0528 đã tạo đƣợc trong thí nghiệm sàng lọc thƣ viện cDNA ở trên (mục 3.1.2.1). Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng đồng thời biến nạp vector pAD/OsNLI-IF vào hai chủng nấm men chỉ thị mang đoạn DNA đích đột biến JRC0332-MU và JRC0528-MU, trong đó vị trí hai motif CCTCCTCC và CTCCAC trên hai đoạn DNA nguyên bản (JRC0332-WT và JRC0528-WT) bị thay thế bằng một trình tự poly-A (Hình 3.10A). Ngồi ra, chủng nấm men chỉ thị mang đoạn DNA đích JRC2606 chứa yếu tố cis DRE và vector biểu hiện pAD/OsRap2.4A đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng [92]. Bên cạnh đó, vector biểu hiện pAD/OsNLI-IF cũng đƣợc biến nạp vào tế bào nấm men mang hai cấu trúc biểu hiện gen chỉ thị HIS3 và lacZ nhƣng khơng chứa đoạn DNA đích trong vùng promoter để làm đối chứng âm trong thí nghiệm Y1H. Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của protein OsNLI-IF đƣợc thể hiện qua sự biểu hiện của hai gen HIS3 và
Hình 3.10: Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF trong nấm men
Ghi chú: (A) Trình tự các đoạn DNA đích ngun bản (WT) và đột biến được thay thế trình
tự lõi bằng đoạn poly-A (MU). (B) Biểu hiện của gen chỉ thị trong tế bào nấm men: (i) sơ đồ bố trí thí nghiệm các chủng nấm men mang các cấu trúc khác nhau, (ĐC+): đối chứng dương (chủng nấm men chỉ thị mang đoạn DNA đích JRC2606 và vector pAD/OsRap2.4A), (ĐC-): đối chứng âm (chủng nấm men YM4271 nguyên bản), (JRC0332-WT, JRC0528- WT, JRC0332-MU, JRC0528-MU): chủng nấm men chỉ thị mang đoạn DNA đích nguyên bản (WT) hay đột biến (MU); (ii) môi trường đầy đủ dinh dưỡng YPD; (iii) môi trường
khuyết dưỡng SD/-Leu/-Ura/-His; (iv) mơi trường khuyết dưỡng SD/-Leu/-Ura/-His có 3-
AT 30 mM; (v) hoạt tính biến đổi cơ chất X-Gal của β-galactosidase.
Kết quả nuôi cấy chọn lọc các thể biến nạp thể hiện trong hình 3.10 cho thấy tất cả các chủng nấm men đều có thể sinh trƣởng bình thƣờng trên mơi trƣờng dinh dƣỡng đầy đủ YPD hay mơi trƣờng khuyết dƣỡng SD/-Leu/-Ura/-His (Hình 3.10B – ii & iii). Tuy nhiên, chỉ có tế bào nấm men mang một trong hai đoạn DNA đích nguyên bản JRC0332-WT và JRC0528-WT có thể sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 3-AT giống nhƣ chủng nấm men đối chứng dƣơng (Hình 3.10B – iv). Đối với gen chỉ thị lacZ, chúng tôi cũng thu đƣợc kết quả tƣơng tự: tất cả các chủng nấm men không mang đoạn DNA đích và mang đoạn DNA đích bị đột biến ở vị trí hai motif CCTCCTCC và CTCCAC đều khơng thể hiện hoạt tính β-galactosidase; trong khi hai chủng nấm men mang trình tự DNA ngun bản có
khả năng biến đổi cơ chất X-Gal và tạo màu xanh (Hình 3.10B – v). Các kết quả này chứng tỏ trong tế bào nấm men, protein dung hợp AD-OsNLI-IF đã liên kết đặc hiệu với đoạn DNA chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC nằm trên vùng promoter của hai gen chỉ thị (HIS3 và lacZ) để hoạt hố q trình phiên mã gen.
Đặc điểm đặc trƣng của một nhân tố phiên mã là khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với yếu tố hoạt hoá cis trong vùng promoter của các gen đích. Nhiều yếu tố cis liên quan tới điều hoà hoạt động gen đáp ứng điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Các nhân tố phiên mã thuộc nhóm DREB1 và DREB2 điều hồ sự biểu hiện của các gen cảm ứng điều kiện hạn và lạnh thông qua sự tƣơng tác với yếu tố DRE có chứa trình tự lõi A/GCCGAC [82]. Hai yếu tố cis CRT và LTRE chứa motif bảo thủ CCGAC tƣơng tự yếu tố DRE xuất hiện trong vùng promoter của một số gen đáp ứng stress nhƣ cor15a, kin1, cor6.6
và cor47/rd17 cũng đƣợc nhận biết bởi các nhân tố phiên mã AP2/ERF [52]. Bằng kỹ thuật Y1H, Tran và nhóm nghiên cứu đã xác định đƣợc trình tự lõi CATGTG của đoạn DNA liên kết đặc hiệu với ba nhân tố phiên mã thuộc họ NAC là ANAC019, ANAC055 và ANAC072 [113]. Tƣơng tự, motif CACTAAATTGT CAC cũng đƣợc chứng minh là trình tự lõi của yếu tố cis ZFHDRS liên kết đặc hiệu với nhân tố đáp ứng hạn và mặn ZFHD1 bằng kỹ thuật Y1H [112]. Trong nghiên