Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR kiểm tra cây chuyển gen pCAMBIA1301 với cặp mồi 35S-
Fw/GUS-t-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1: đối chứng âm (khuôn là DNA tách chiết từ cây thuốc lá dại), giếng 2 – 10: khuôn là mẫu DNA tách chiết từ các dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301; giếng 11: đối chứng dương (khuôn là
pCAMBIA1301). (B) Sản phẩm PCR kiểm tra cây chuyển gen pCAM/OsNLI-IF-S với cặp
mồi NLI-t-Fw/Nos-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1: đối chứng âm (khuôn là DNA tách chiết từ cây thuốc lá dại), giếng 2: đối chứng dương (khuôn là pCAM/OsNLI-IF- S); giếng 3 – 11: khuôn là mẫu DNA tách chiết từ các dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
10 dòng cây tái sinh đƣợc chuyển cấu trúc pCAMBIA1301 (đặt tên là ĐC1 – ĐC10) và 10 dòng cây tái sinh đƣợc chuyển cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF (đặt tên là TL1-TL10) có kết quả PCR dƣơng tính từ mỗi thí nghiệm chuyển gen đƣợc chúng tôi chọn lọc ngẫu nhiên để sử dụng cho các thí nghiệm phân tích biểu hiện gen tiếp theo. Các dịng cây tái sinh này đƣợc chuyển ra trồng trong chậu đất và tiếp tục cho sinh trƣởng trong điều kiện nhà kính để thu hạt phục vụ thí nghiệm phân tích cây T1 (Hình 3.26G, H & I).
3.4.2.2. Phân tích khả năng nảy mầm của các dịng thuốc lá chuyển gen
Q trình chuyển DNA ngoại lai vào hệ gen tế bào thực vật có thể gây ra một số xáo trộn trong hệ thống điều hoà hoạt động gen của tế bào, làm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây chủ. Ngồi ra, trong thí nghiệm chuyển gen vào thuốc lá chúng tơi sử dụng hệ vector pCAMBIA1301 nên các dòng cây tái sinh sẽ có mang gen chọn lọc kháng Hygromycin. Do đó, khả năng nảy mầm của các dòng thuốc lá chuyển gen đã đƣợc khảo sát trên hai loại môi trƣờng dinh dƣỡng: mơi trƣờng MS bình thƣờng và mơi trƣờng MS có bổ sung chất kháng sinh Hygromycin 50 mg/l.
ly tính trạng), các dịng thuốc lá chuyển gen có tỉ lệ nảy mầm cao trên môi trƣờng dinh dƣỡng bình thƣờng (>95%) đƣợc tiếp tục khảo sát khả năng nảy mầm trên mơi trƣờng có Hygromycin (Phụ lục 13). Ngoài ra, nhằm loại bỏ những dòng cây chuyển gen có mang nhiều bản sao của cấu trúc biểu hiện gen đích trên các NST khác nhau, chúng tôi chọn lọc các dịng có tỉ lệ phân ly kiểu hình [kháng Hygromycin] : [khơng kháng Hygromycin] đạt xấp xỉ 3:1. Kết quả thu đƣợc cho thấy các dòng TL1, TL3, TL4, TL7, TL8, TL10 và ĐC2, ĐC3, ĐC8, ĐC9 có tỉ lệ nảy mầm đạt 65 – 85 % (Bảng 3.6), gần với tỉ lệ phân ly 3:1. Các cây thuốc lá T1 kháng Hygromycin từ các dòng này đƣợc chọn lọc để tiếp tục phân tích đặc điểm di truyền.
Bảng 3.5: Tỉ lệ nảy mầm của các dòng thuốc lá T1 trên mơi trƣờng MS.
Tên dịng Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt Tỉ lệ % Tên dòng Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt Tỉ lệ % TL1 48/50 96,0 ĐC1 40/52 76,9 TL2 45/51 88,2 ĐC2 45/47 95,7 TL3 53/55 96,4 ĐC3 51/53 96,2 TL4 47/49 95,9 ĐC4 52/53 98,1 TL5 31/55 56,4 ĐC5 50/54 92,6 TL6 12/50 24,0 ĐC6 49/52 94,2 TL7 49/50 98,0 ĐC7 48/52 92,3 TL8 53/55 96,4 ĐC8 48/48 100 TL9 52/55 94,6 ĐC9 49/50 98,0 TL10 47/48 97,9 ĐC10 47/53 88,7
TL: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF. ĐC: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301.
thí nghiệm chuyển gen thực vật sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens, mặc dù tần suất chuyển gen khá thấp nhƣng T-DNA vẫn có thể chèn vào hai hoặc nhiều vị trí khác nhau trong hệ gen tế bào chủ [19]. Chính vì vậy, đối với các đối tƣợng thực vật là loài tự thụ phấn, ở thế hệ con lai F1 có thể xuất hiện tỉ lệ phân ly kiể
3:1, 15:1 hoặc những tỉ lệ phân ly bất thƣờng khác [89]. Phƣơng pháp sàng lọc cây chuyển gen T1 dựa trên sự phân ly kiểu hình biểu hiện của gen chọn lọc đã đƣợc một số nghiên cứu trƣớc đây áp dụng để xác định những dòng cây chuyển gen có mang một bản sao của gen đích [63, 114, 115]. Ở đây, chúng tôi cũng sàng lọc các
dòng cây chuyển gen T1 bằng phƣơng pháp gieo hạt trên mơi trƣờng có Hygromycin 50 mg/l. Mặc dù chƣa thể khẳng định các dòng cây chuyển gen đƣợc chọn có mang duy nhất một bản sao của cấu trúc T-DNA, tỉ lệ phân ly giữa các cây kháng và không kháng Hygromycin xấp xỉ 3:1 cũng chứng tỏ các dòng cây chuyển gen này khơng mang nhiều bản sao của gen đích cùng hoạt động trên các NST khác nhau [114].
Bảng 3.6: Tỉ lệ nảy mầm của các dòng thuốc lá T1 trên mơi trƣờng MS có Hygromycin 50 mg/l. Tên dòng Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt Tỉ lệ % Tên dòng Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt Tỉ lệ % TL1 35/51 68,6 ĐC2 42/50 84,0 TL3 44/52 84,6 ĐC3 41/54 75,9 TL4 38/50 76,0 ĐC4 45/49 91,8 TL7 39/54 72,2 ĐC8 38/51 74,5 TL8 34/52 65,4 ĐC9 41/52 78,9 TL9 47/49 95,9 TL10 40/51 78,4
TL: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF. ĐC: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301.
3.4.2.3. Xác định sự có mặt của OsNLI-IF trong cây thuốc lá T1 bằng PCR
Sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen đích (T-DNA) trong hệ gen của các dòng cây T1 đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau (Bảng 3.7). Các cây non 2 tuần tuổi nảy mầm trên mơi trƣờng dinh dƣỡng có Hygromycin 50 mg/l đƣợc cắt lá để nghiền trong hỗn hợp đệm Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 và NaOH 0,5 M, sau đó đƣợc dùng làm khn cho PCR.
Kết quả PCR kiểm tra mẫu DNA tách chiết từ các cây thuốc lá chuyển gen T1 bằng cặp mồi đặc hiệu của gen actin (Actin-Fw/Actin-Rv) trong bảng 3.7 cho thấy tất cả các phản ứng đều cho kết quả dƣơng tính, chứng tỏ mẫu DNA tách chiết hồn toàn đạt yêu cầu. Kết quả PCR kiểm tra các cây chuyển gen bằng cặp mồi đặc hiệu cho gen chọn lọc Hygromycin (Hyg-Fw/Hyg-Rv) cho thấy mặc dù có thể nảy mầm trên mơi trƣờng có Hygromycin nhƣng không phải tất cả các cây T1 kháng Hygromycin đều mang gen kháng Hygromycin; tỉ lệ cây có mang gen kháng
Hygromycin dao động từ 60% - 100% (Bảng 3.7). Tuy nhiên, tất cả các cây có kết quả PCR dƣơng tính với cặp mồi Hyg-Fw/Hyg-Rv đều cho kết quả dƣơng tính khi đƣợc kiểm tra bằng cặp mồi đặc hiệu cho gen đích OsNLI-IF (Bảng 3.7, dòng TL1, TL3, TL4, TL7, TL8; Phụ lục 14) hay cặp mồi đặc hiệu cho gen GUS (Bảng 3.7,
dòng ĐC2, ĐC3, ĐC8 và ĐC9). Ngƣợc lại, mẫu DNA tách chiết từ dòng thuốc lá không chuyển gen đối chứng khơng cho kết quả PCR dƣơng tính với các cặp mồi này (Phụ lục 14). Kết quả này cho phép chúng tôi bƣớc đầu khẳng định đã thu đƣợc các cây thuốc lá chuyển gen T1 có mang cấu trúc biểu hiện gen mong muốn. Các cây chuyển gen T1 kháng Hygromycin và có kết quả PCR dƣơng tính đƣợc chuyển sang trồng trong chậu đất để phục vụ các thí nghiệm phân tích tiếp theo.
Bảng 3.7: Kết quả phân tích PCR các dịng thuốc lá T1.
Dịng cây
Số cây kiểm tra
Tỉ lệ cây có kết quả PCR dƣơng tính
Mồi Actin Mồi Hygromycin Mồi GUS Mồi OsNLI-IF
TL1 20 20/20 18/20 18/20 18/20 TL3 20 20/20 15/20 15/20 15/20 TL4 20 20/20 20/20 20/20 20/20 TL7 20 20/20 17/20 17/20 17/20 TL8 20 20/20 12/20 12/20 12/20 TL10 20 20/20 18/20 18/20 18/20 ĐC2 10 10/10 8/10 8/10 0/10 ĐC3 10 10/10 6/10 6/10 0/10 ĐC8 10 10/10 8/10 8/10 0/10 ĐC9 10 10/10 10/10 10/10 0/10
TL: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF. ĐC: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301.
3.4.2.4. Phân tích mức độ biểu hiện OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá T1
Cấu trúc biểu hiện gen đích OsNLI-IF mặc dù đã đƣợc xác định có mặt trong cây chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR nhƣng protein quan tâm có đƣợc biểu hiện trong cây chuyển gen hay không phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, ví dụ nhƣ vị trí chèn cấu trúc biểu hiện gen đích, số bản sao của gen đích trong hệ gen cây chủ… [19]. Chính vì vậy, thí nghiệm phân tích mức độ biểu hiện của OsNLI-IF trong cây chuyển gen đã đƣợc tiến hành trên cơ sở xác định mức độ tích luỹ protein OsNLI-IF
trong mơ bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể đa dòng kháng đặc hiệu protein tái tổ hợp OsNLI-IF.
Để tạo kháng thể kháng protein OsNLI-IF, chúng tôi đã gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch bằng protein OsNLI-IF tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli. Protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện tối ƣu trong điều kiện nuôi cấy vi khuẩn ở 20oC với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,1 mM trong thời gian 5 (Phụ lục 15), sau đó đƣợc tinh sạch bằng hệ thống cột sắc ký ái lực Ni-NTA. Kết quả SDS-PAGE và lai thẩm tách miễn dịch (sử dụng kháng thể anti – His-tag) cho thấy protein tái tổ hợp đã đƣợc thu lại ở dạng tinh sạch và có kích thƣớc 52 kDa tƣơng ứng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết của protein dung hợp OsNLI-IF (Hình 3.28A & B). Protein dung hợp đƣợc chúng tôi xử lý với Thrombin để loại đuôi His- tag (Phụ lục 16) và sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên chuột.