Protein tƣơng tác OsNLI-IF Số dòng khuẩn lạc
Polyubiquitin 2
Protein kép chứa domain phosphatase đặc hiệu cho protein 1
Protein liên kết kẽm, thuộc nhóm Alcohol dehydrogenase 1
Protein chƣa đƣợc nghiên cứu 1
Protein liên kết chlorophyll a/b nhóm I, tiền chất của chloroplast 1
Cyclophilin 2 1
Tiểu phần U5 200 kDa của helicase 1
Ở thực vật, quá trình biến đổi protein sau dịch mã có vai trị quan trọng trong việc liên kết các thành phần của mạng lƣới truyền tín hiệu stress phức tạp trong tế bào. Các tƣơng tác protein-protein có thể dẫn tới một số q trình biến đổi protein sau phiên mã, liên quan tới quá trình điều hòa chức năng của nhiều nhân tố phiên mã tham gia vào bộ máy đáp ứng chống chịu yếu tố stress của tế bào [127]. Ví dụ, tƣơng tác giữa các nhân tố phiên mã MYB thuộc nhóm R3-MYB với một số protein bHLH có ý nghĩa quyết định hoạt tính điều hịa phiên mã của nhân tố này [35]. Bằng kỹ thuật Y2H, Lai và nhóm nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính liên kết DNA của nhân tố phiên mã AtWRKY33 đƣợc điều hịa thơng qua tƣơng tác với hai protein SIB1 và SIB2 [67]. Tƣơng tự, trong thí nghiệm này chúng tơi cũng đã xác định đƣợc các protein có khả năng tƣơng tác với nhân tố phiên mã OsNLI-IF bằng thí nghiệm Y2H. Đặc biệt, trong số các dòng cDNA đƣợc phân
lập, có hai dịng mã hóa cho protein ubiquitin, cho thấy có thể q trình ubiquitin hóa là một trong những bƣớc biến đổi sau phiên mã của protein OsNLI-IF. Thực tế, hoạt tính điều hịa phiên mã của nhiều nhân tố phiên mã kiểm soát biểu hiện các gen đáp ứng với điều kiện stress ở thực vật cũng đƣợc điều hịa thơng qua liên kết với protein ubiquitin hay protein SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier protein). Ở A. thaliana, AtMYB18 đƣợc phát hiện xảy ra ubiquitin hóa tại vị trí
các gốc Lysine gần vị trí với domain hoạt hóa phiên mã, qua đó tăng cƣờng hoạt tính hoạt hóa phiên mã của nhân tố phiên mã [35]. Qin và nhóm nghiên cứu đã phân lập đƣợc hai protein liên kết với nhân tố phiên mã DREB2A điều hòa đáp ứng chống chịu hạn ở A. thaliana, đặt tên là DRIP1 và DRIP2, có vai trị trung gian cho quá trình ubiquitin hóa protein DREB2A. Quá trình phiên mã của gen
DREB1/CBF đƣợc phát hiện chịu sự kiểm soát của nhân tố hoạt hóa phiên mã
ICE1 và tính ổn định của protein này đƣợc điều hịa thơng qua q trình ubiquitin hóa bởi protein HOS1 [82].
Hình 3.16: Sơ đồ q trình điều hịa hoạt động chức năng của OsNLI-IF
Ghi chú: Trong điều kiện hạn, mặn, lạnh hay nhiệt độ cao, tế bào thực vật hoạt hố con
đường truyền tín hiệu stress vào nhân tế bào, khởi động quá trình phiên mã và tổng hợp OsNLI-IF. Protein OsNLI-IF trải qua các bước biến đổi sau dịch mã, trở thành nhân tố phiên mã hoàn chỉnh, liên kết với yếu tố cis CCTCCTCC và CTCCAC trong vùng promoter và hoạt hố sự biểu hiện của các gen đích tham gia vào đáp ứng chống chịu stress.
Trong nghiên cứu này, mặc dù chƣa xác định đƣợc cơ chế chính xác cũng nhƣ vai trị của các tƣơng tác giữa OsNLI-IF với trình tự DNA đích và các protein khác trong tế bào thực vật, bằng các thí nghiệm lai phân tử trong tế bào nấm men (Y1H và Y2H), chúng tôi đã chứng minh đƣợc protein OsNLI-IF có đồng thời cả hai hoạt tính liên kết DNA và hoạt hóa phiên mã. Nhân tố phiên mã OsNLI-IF có thể tƣơng tác với các vùng promoter chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC để điều hịa q trình phiên mã của gen đích. Q trình biểu hiện protein OsNLI-IF đã đƣợc chứng minh là cảm ứng với nhiều yếu tố stress khác nhau (hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao, mất nƣớc) và có thể liên quan tới q trình ubiquitin hóa. Từ các kết quả thí nghiệm thu đƣợc, chúng tơi đƣa ra mơ hình hoạt động dự đốn của protein OsNLI-IF nhƣ trong hình 3.16. Tuy nhiên, vai trò của OsNLI-IF đối với đáp ứng chống chịu stress của thực vật vẫn cần phải đƣợc chứng minh bằng các thí nghiệm tiếp theo trên cây chuyển gen.
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT
3.3.1. Thiết kế hệ vector biểu hiện pCAMBIA1301
Để phục vụ thí nghiệm nghiên cứu chức năng in vivo của OsNLI-IF trong cây chuyển gen, chúng tôi tiến hành thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF, sử dụng promoter hoạt động liên tục 35S. Trình tự mã hố của OsNLI-IF đƣợc ghép nối vào vector trung gian pRT101tại vị trí nằm giữa promoter 35S và vùng tín hiệu kết thúc phiên mã (poly-A); cấu trúc biểu hiện gen 35S:OsNLI-IF sau đó đƣợc cắt và ghép nối vào vector nhị phân pCAMBIA1301 theo sơ đồ trình bày trong hình 2.2.
3.3.1.1. Thiết kế cấu trúc biểu hiện OsNLI-IF điều khiển bởi promoter 35S
Vector pRT101 là một vector nhân dòng trung gian đƣợc thiết kế mang vùng MCS nằm giữa trình tự promoter 35S và trình tự tín hiệu kết thúc phiên mã poly-A
[111]. Trong thí nghiệm này, đoạn gen OsNLI-IF 1,3 kb đƣợc chúng tôi cắt khỏi vector nhân dòng pGEM/OsNLI-IF và ghép nối vào vị trí nhận biết của enzyme
EcoRI trên vector pRT101 (Hình 2.2 & Hình 3.17A). Hỗn hợp phản ứng ghép nối
DNA bằng T4 DNA ligase đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α; thể biến nạp xuất hiện trên mơi trƣờng LB có Ampicillin sau đó đƣợc sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR
trực tiếp khuẩn lạc với đồng thời hai cặp mồi 35S-Fw/EcoRI-NLI-Rv và 35S- Fw/XhoI-NLI-Fw (Bảng 2.1) để xác định chiều của gen OsNLI-IF trên vector tái tổ hợp. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose cho thấy trong số 5 khuẩn lạc đƣợc kiểm tra có 2 khuẩn lạc mang đoạn gen OsNLI-IF xuôi chiều, sản phẩm PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Fw cho 1 băng DNA 1,4 kb (Hình 3.17B, giếng 7 9) và 3 khuẩn lạc mang đoạn gen OsNLI-IF ngƣợc chiều có kết quả PCR dƣơng tính với cặp mồi 35S-Fw/EcoRI-NLI-Rv (Hình 3.17B, giếng 2, 4 5).
Hình 3.17: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pRT101
Ghi chú: (A) Cắt giới hạn pGEM/OsNLI-IF và pRT101 bằng EcoRI và điện di sản phẩm
trên gel agarose 1%; giếng 1 và 2: pGEM/OsNLI-IF; giếng 3 và 4: pRT101; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 4: vector nguyên bản. (B) PCR trực tiếp khuẩn lạc và điện di trên gel agarose 1%; giếng 1 – 6: PCR với cặp mồi 35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 7 – 12: PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv: giếng 1 – 5 và 7 – 11: khuôn là khuẩn lạc số 1 – 5; giếng 6 và 12: đối chứng âm (khơng có DNA khn). Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Để khẳng định sự có mặt của đoạn gen OsNLI-IF trong vector tái tổ hợp,
DNA plasmid đƣợc tinh sạch từ các thể biến nạp dƣơng tính và kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR và cắt giới hạn. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy với PCR sử dụng cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv, cả 2 plasmid tái tổ hợp đều cho băng DNA khoảng 1,3 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của OsNLI-IF (Hình 3.17A, giế 4). Trong khi đó, với cặp mồi 35S-Fw/ XhoI-NLI-Rv hay 35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw, chỉ có sản phẩm PCR từ vector mang đoạn gen tƣơng ứng OsNLI-IF xuôi chiều (pR101/OsNLI-IF-S) hay ngƣợc chiều (pR101/OsNLI-IF-S) cho kết quả dƣơng tính (35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw) (Hình 3.18A, giế 5). Trong thí nghiệm xử lý hai vector tái tổ hợp bằng PstI, kết
vector pRT101) và 2,0 kb (tƣơng ứng với kích thƣớc cấu trúc biểu hiện gen
35S:OsNLI-IF:Poly-A) (Hình 3.18B, giế 3). Các kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã thu đƣợc vector tái tổ hợp mang đoạn gen đích OsNLI-IF. Cả hai cấu trúc sẽ đƣợc sử dụng để thiết kế vector biểu hiện pCAMBIA1301 mang trình tự có nghĩa (sense) và đối nghĩa (antisense) của gen OsNLI-IF.
Hình 3.18: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pRT/OsNLI-IF-S và pRT/OsNLI-IF-AS
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
plasmid tái tổ hợp; giếng 1 và 4: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2 và 5: PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 3 và 6: PCR với cặp mồi 35S- Fw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 1 – 3: khuôn là pRT/OsNLI-IF-S; giếng 4 – 6: khuôn là pRT/OsNLI-IF-AS. (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng PstI ; giếng 1 và 2:
pRT/OsNLI-IF-S; giếng 3 và 4: pRT/NLI-IF-AS; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 4: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
3.3.1.2. Ghép nối cấu trúc biểu hiện OsNLI-IF vào vector pCAMBIA1301
Vector pCAMBIA1301 là một Ti plasmid (Tumor inducing plasmid) nhân tạo có mang cấu trúc biểu hiện gen chọn lọc kháng Hygromycin và vùng MCS đƣợc thiết kế để biểu hiện gen quan tâm trong tế bào thực vật (Hình 2.2). Trong thí nghiệm này, các vector pR101/OsNLI-IF-S, pR101/OsNLI-IF-AS và vector pCAMBIA1301 đã đƣợc lần lƣợt xử lý với enzyme HindIII; hai cấu trúc 35S:OsNLI-IF-S và 35S:OsNLI-IF-AS sau đó đƣợc ghép nối vào vector nhị phân
pCAMBIA1301 (Hình 3.19A). Hỗn hợp phản ứng ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α và ni cấy trên mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung kháng sinh Kanamycin (100 µg/ml). Kết quả kiểm tra các thể biến nạp bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv
cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc một số khuẩn lạc dƣơng tính có mang đoạn gen đích OsNLI-IF (Hình 3.19B, giếng 1-7 và 9-15).
Hình 3.19: Ghép nối cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào vector pCAMBIA1301
Ghi chú: (A) Cắt giới hạn pCAMBIA1301, pRT/OsNLI-IF-S và pRT/OsNLI-IF-AS bằng
HindIII và điện di sản phẩm trên gel agarose 1%; giếng 1 và 2: pCAMBIA1301; giếng 3 và 4: pRT/OsNLI-IF-S; giếng 5 và 6: pRT/OsNLI-IF-AS; giếng 1, 4 và 6: vector nguyên bản; giếng 2, 3 và 5: sản phẩm cắt giới hạn. (B) Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với
cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1 – 7: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp pCAM-35S/OsNLI-IF-S số 1 – 7; giếng 9 – 15: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp pCAM-35S/OsNLI-IF-AS số 1 – 7; giếng 8 và 16: đối chứng âm (khơng có DNA khn). Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Để khẳng định kết quả thu đƣợc, plasmid đƣợc tinh sạch từ các khuẩn lạc dƣơng tính và kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi khác nhau và bằng enzyme giới hạn HindIII và EcoRI. Kết quả điện di sản phẩm PCR với ba cặp mồi EcoRI-NLI- Fw/XhoI-NLI-Rv, 35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw hoặc 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv, 35S- Fw/GUS-Rv cho thấy sự xuất hiện của các băng DNA có kích thƣớc lần lƣợt 1,3 kb, 1,4 kb và 0,9 kb tƣơng ứng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết của từng đoạn DNA (Hình 3.20A & B, giếng 1-3). Đối với thí nghiệm cắt giới hạn bằng enzyme HindIII, sản phẩm phản ứng cho 2 băng DNA, trong đó băng DNA có kích thƣớc 2,0 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của cấu trúc 35S:OsNLI-IF (Hình 3.20A & B, giếng 5).
Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện pCAMBIA1301 mang trình tự có nghĩa (sense) hay đối nghĩa (antisense) của gen
OsNLI-IF, đặt dƣới sự điều khiển của promoter 35S. Kết luận này đƣợc khẳng định
hơn nhờ thí nghiệm xử lý vector tái tổ hợp với enzyme EcoRI, trong đó sản phẩm
cắt giới hạn khi đƣợc điện di trên gel agarose 1% cho 3 băng DNA: bộ khung vector pCAMBIA1301 dài khoảng 12 kb, đoạn gen OsNLI-IF dài 1,3 kb và promoter dài
0,45 kb (đối với pCAM/OsNLI-IF-S) hoặc vùng kết thúc phiên mã dài 0,3 kb (đối với pCAM/ OsNLI-IF-AS) (Hình 3.20A & B, giếng 7).
Hình 3.20: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) Vector
pCAM/OsNLI-IF-S; (B) Vector pCAM/OsNLI-IF-AS. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2: PCR với cặp mồi 35S- Fw/GUS-Rv; giếng 3(A): PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 3(B): PCR với cặp mồi 35S-Fw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 4: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 5: cắt giới hạn bằng HindIII; giếng 6: vector nguyên bản; giếng 7: cắt giới hạn bằng EcoRI.
Các nghiên cứu trƣớc đây về nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu yếu tố stress phi sinh học, bao gồm cả hạn hán, sử dụng rất phổ biến các cấu trúc promoter hoạt động mạnh, trong đó đặc biệt là promoter 35S, để chứng minh
chức năng của gen đích trong cây chuyển gen mơ hình [34, 44, 77, 94, 112, 113]. Promoter 35S có nguồn gốc từ virus CaMV (Cauliflower Mosaic Virus), có kích
thƣớc khá nhỏ (vài trăm bp) và hoạt động rất mạnh ở hầu hết tất cả các loại tế bào/mô thực vật, trong mọi giai đoạn phát triển, đặc biệt là ở đối tƣợng cây hai lá mầm. Chính vì vậy, promoter 35S là cấu trúc đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong
nghiên cứu chuyển gen thực vật, chiếm tới hơn 80% số lƣợng thực vật chuyển gen [46, 85]. Ở đây, chúng tôi cũng sử dụng promoter 35S trong thiết kế cấu trúc biểu
hiện gen OsNLI-IF để nghiên cứu chức năng của gen đích trong cây chuyển gen mơ hình (thuốc lá) nhằm chứng minh ảnh hƣởng của nhân tố phiên mã OsNLI-IF đối với khả năng chống chịu stress của cây. Ngoài ra, do OsNLI-IF là gen nội sinh có mặt trong hệ gen của lúa, vì vậy để phục vụ nghiên cứu chức năng OsNLI-IF trong
cây lúa chuyển gen sau này, cấu trúc biểu hiện gen mang trình tự đối mã của gen
OsNLI-IF (anti-sense) cũng đƣợc thiết kế để sử dụng làm đối chứng âm trong thí nghiệm chuyển gen vào lúa, trong đó các phân tử mRNA đối mã có vai trị bất hoạt các gen tƣơng đồng với gen quan tâm có trong cây chuyển gen.
3.3.2. Thiết kế hệ vector biểu hiện pBI101
Với mục đích nghiên cứu chức năng của nhân tố phiên mã OsNLI-IF trong cây mơ hình và hƣớng tới mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu tạo giống cây trồng chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi, chúng tôi đã sử dụng vector pBI101 (Clontech) để thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF đặt dƣới sự
điều khiển của promoter Ubiquitin hoạt động liên tục và promoter Lip9 hoạt động
cảm ứng điều kiện stress. Vector nhị phân pBI101 nguyên bản đã đƣợc xử lý với enzyme giới hạn SmaI/SacI nhằm loại bỏ gen chỉ thị GUS và thay thế bằng một
trình tự “chuyển tiếp” (Adapter) trƣớc khi ghép nối với trình tự promoter (Ubiquitin hay Lip9) và vùng kết thúc phiên mã (NosT) để tạo thành vector pBI101-Lip9-NosT (pBI-Lip9) và pBI101-Ubi-NosT (pBI-Ubi) sử dụng cho nghiên cứu (Hình 2.3).
3.3.2.1. Ghép nối đoạn gen OsNLI-IF vào vector pBI101
Khung đọc mở của gen OsNLI-IF đƣợc nhân bản bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-Rv, sử dụng Pfu DNA polymerase để tạo ra sản
phẩm PCR có đầu bằng (Hình 3.21A). Sản phẩm PCR tinh sạch sau đó đƣợc ghép nối lần lƣợt vào vector pBI-Ubi và pBI-Lip9 mạch thẳng đã đƣợc xử lý trƣớc đó bằng enzyme giới hạn tạo đầu bằng SmaI (Hình 3.21B) nhờ sự xúc tác của T4 DNA ligase; hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α để sàng lọc thể biến nạp trên mơi trƣờng LB có chứa Kanamycin 50 µg/ml.
Thể biến nạp dƣơng tính mang trình tự gen OsNLI-IF có nghĩa (sense) đƣợc chọn lọc bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi Ubi- Fw/SmaI-NLI-Rv (đối với vector pBI-Ubi) và Lip9-Fw/SmaI-NLI-Rv (đối với vector pBI-Lip9). Dựa trên kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, chúng tôi đã chọn lọc đƣợc một số thể biến nạp có mang vector pBI-Lip9 và pBI-Ubi chứa trình tự có nghĩa (sense) của gen OsNLI-IF, sản phẩm PCR trực
tiếp khuẩn lạc cho 1 băng DNA kích thƣớc khoảng 1,4 kb (Hình 3.22, giếng 1-3, 5, 9, 12, 15, 17 và 18).
Hình 3.21: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pBI-Ubi và pBI-Lip9