Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CU & THẢO LUẬN
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF
3.3.2. Thiết kế hệ vector biểu hiện pBI101
Với mục đích nghiên cứu chức năng của nhân tố phiên mã OsNLI-IF trong cây mơ hình và hƣớng tới mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu tạo giống cây trồng chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi, chúng tôi đã sử dụng vector pBI101 (Clontech) để thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF đặt dƣới sự
điều khiển của promoter Ubiquitin hoạt động liên tục và promoter Lip9 hoạt động
cảm ứng điều kiện stress. Vector nhị phân pBI101 nguyên bản đã đƣợc xử lý với enzyme giới hạn SmaI/SacI nhằm loại bỏ gen chỉ thị GUS và thay thế bằng một
trình tự “chuyển tiếp” (Adapter) trƣớc khi ghép nối với trình tự promoter (Ubiquitin hay Lip9) và vùng kết thúc phiên mã (NosT) để tạo thành vector pBI101-Lip9-NosT (pBI-Lip9) và pBI101-Ubi-NosT (pBI-Ubi) sử dụng cho nghiên cứu (Hình 2.3).
3.3.2.1. Ghép nối đoạn gen OsNLI-IF vào vector pBI101
Khung đọc mở của gen OsNLI-IF đƣợc nhân bản bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-Rv, sử dụng Pfu DNA polymerase để tạo ra sản
phẩm PCR có đầu bằng (Hình 3.21A). Sản phẩm PCR tinh sạch sau đó đƣợc ghép nối lần lƣợt vào vector pBI-Ubi và pBI-Lip9 mạch thẳng đã đƣợc xử lý trƣớc đó bằng enzyme giới hạn tạo đầu bằng SmaI (Hình 3.21B) nhờ sự xúc tác của T4 DNA ligase; hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α để sàng lọc thể biến nạp trên mơi trƣờng LB có chứa Kanamycin 50 µg/ml.
Thể biến nạp dƣơng tính mang trình tự gen OsNLI-IF có nghĩa (sense) đƣợc chọn lọc bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi Ubi- Fw/SmaI-NLI-Rv (đối với vector pBI-Ubi) và Lip9-Fw/SmaI-NLI-Rv (đối với vector pBI-Lip9). Dựa trên kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, chúng tôi đã chọn lọc đƣợc một số thể biến nạp có mang vector pBI-Lip9 và pBI-Ubi chứa trình tự có nghĩa (sense) của gen OsNLI-IF, sản phẩm PCR trực
tiếp khuẩn lạc cho 1 băng DNA kích thƣớc khoảng 1,4 kb (Hình 3.22, giếng 1-3, 5, 9, 12, 15, 17 và 18).
Hình 3.21: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pBI-Ubi và pBI-Lip9
Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR nhân bản OsNLI-IF với cặp mồi SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-
Rv được điện di trên gel agarose 1%; giếng 1: đối chứng âm (khơng có DNA khuôn); giếng 2: khuôn là pGEM/OsNLI-IF. (B) Cắt giới hạn pBI-Ubi và pBI-Lip9 bằng SmaI và điện di sản phẩm trên gel agarose 1%; giếng 1 và 2: vector pBI-Ubi; giếng 3 và 4: vector pBI-Lip9; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 4: vector nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Hình 3.22: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc được điện di trên gel agarose 1%. Giếng 1 –
10: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 1 – 9: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp pBI-Ubi/OsNLI-IF số 1 – 9; giếng 11 – 18: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 12 – 18: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp pBI-Lip9/OsNLI-IF số 1 – 7; giếng 10 và 11: đối chứng âm (khơng có DNA khuôn); giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
3.3.2.2. Kiểm tra vector tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF
Để khẳng định sự có mặt đoạn gen OsNLI-IF trên plasmid tái tổ hợp trong các thể biến nạp, DNA plasmid đƣợc tách chiết và kiểm tra bằng PCR và phản ứng
cắt enzyme giới hạn. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu của OsNLI-IF và cặp mồi đặc hiệu của khung vector ch
các băng DNA có kích thƣớc đúng với kích thƣớc lý thuyết, lần lƣợt là 1,3 kb (Hình 3.23A, giếng 2 và 5) và 1,4 kb (Hình 3.23A, giếng 3 và 6). Khi xử lý plasmid tái tổ hợp với enzyme SmaI, sản phẩm phản ứng cho 2 băng DNA trên bản điện di (Hình 3.23B, giếng 1 và 3), trong đó có một băng 1,3 kb tƣơng ứng với đoạn gen OsNLI-
IF, một băng có kích thƣớc lớn hơn 10 kb tƣơng ứng với bộ khung vector. Kết quả
này chứng tỏ plasmid tái tổ hợp thu đƣợc có mang đoạn gen đích OsNLI-IF.
Hình 3.23: PCR và cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNLI-IF trong plasmid tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
plasmid tái tổ hợp; giếng 1 – 3: khuôn là pBI-Ubi/OsNLI-IF; giếng 4 – 6: khuôn là pBI- Lip9/OsNLI-IF; giếng 1: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Fw; giếng 2 và 5: PCR với cặp mồi SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 3: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/SmaI-NLI-Fw; giếng 6: PCR với cặp mồi Lip9- Fw/SmaI-NLI-Rv. (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng SmaI; giếng 1 và 2: pBI-
Ubi/OsNLI-IF; giếng 3 và 4: pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 4: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Vector tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF sau đó đƣợc giải trình tự nucleotide với mồi Ubi-Fw (đối với vector pBI-Ubi) hoặc Lip9-Fw (đối với vector pBI-Lip9) và NosT-Rv (cho cả hai vector) để khẳng định chính xác hơn kết quả ghép nối gen OsNLI-IF. Kết quả so sánh trình tự sau khi xử lý bằng phần mềm BioEdit cho thấy trình tự đoạn gen đƣợc ghép nối tƣơng đồng 100% với trình tự đã đƣợc phân lập ban đầu (mục 3.1.3.3); trình tự DNA giải đƣợc có mang đầy đủ promoter Ubiquitin/Lip9 và vùng kết thúc phiên mã NosT. Kết quả này cho phép
khẳng định ghép nối thành công đoạn gen OsNLI-IF vào hệ vector biểu hiện pBI101, đặt dƣới sự điều khiển của hai promoter Lip9 và Ubiquitin.
Ubiquintin là một promoter hoạt động liên tục có nguồn gốc từ cây ngô đã
đƣợc nghiên cứu chức năng khá chi tiết [26, 29, 91]. Do có khả năng hoạt hố sự biểu hiện gen ở mức độ cao (gấp 10 lần promoter 35S) trong tất cả các mơ/cơ quan có thể quan sát, promoter Ubiquitin đƣợc sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu
chuyển gen ở cây ngũ cốc, đặc biệt là cây lúa [29, 42]. Một số nghiên cứu về gen mã hoá nhân tố phiên mã nhƣ OsDREB1, OsNAC5 hay OsNAC6 cũng đã sử dụng
promoter này cho thí nghiệm chuyển gen vào cây lúa mơ hình [48, 109, 113]. Trong nghiên cứu này, khung đọc mở của OsNLI-IF với trình tự promoter Ubiquitin trên bộ khung vector nhị phân pBI101 để tạo vật liệu cho thí
nghiệm chuyển gen OsNLI-IF vào cây lúa.
Việc sử dụng các promoter hoạt động liên tục nhƣ 35S, Ubiquitin hay Actin… để biểu hiện gen quan tâm trong cây chuyển gen thƣờng mang lại hiệu quả rõ rệt. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp, sự biểu hiện liên tục của một gen đáp ứng điều kiện stress lại gây ảnh hƣởng tiêu cực tới sinh trƣởng và phát triển của thực vật trong điều kiện bình thƣờng [28, 85]. Một giải pháp cho vấn đề này là sử dụng các promoter chỉ cảm ứng hoạt động đặc hiệu trong những điều kiện stress nhất định, ví dụ nhƣ RD29A (A. thaliana), OsNAC6 và OsLEA3-1 (lúa), HVA22 (lúa mạch)... Promoter Lip9 là
một trong số các promoter hoạt động đặc hiệu đƣợc phân lập từ lúa, đã đƣợc chứng minh cảm ứng với điều kiện hạn, mặn và ABA [85]. Các dòng lúa đƣợc chuyển cấu trúc Lip9:OsNAC6 hay Lip9:DREB1A bên cạnh khả năng chịu hạn cao cịn có tốc độ sinh trƣởng trong điều kiện bình thƣờng cao hơn rõ rệt so với các dịng lúa biểu hiện liên tục gen chuyển, chứng tỏ sự hoạt động của promoter Lip9 không gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây chuyển gen [85, 113]. Trong nghiên cứu này, cấu trúc biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF đặt dƣới sự điều khiển của promoter
Lip9 đã đƣợc thiết kế để phục vụ cho các nghiên cứu sau này hƣớng tới mục tiêu tạo
ra giống cây trồng chuyển gen chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của môi trƣờng, đồng thời vẫn cho năng suất ổn định trong điều kiện bình thƣờng.