2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Thƣ viện cDNA sơ cấp của lúa Oryza sativa L. Pusa Basmati 1 (PB1) do Bộ môn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp đƣợc tổng hợp từ mẫu mRNA hỗn hợp của cây lúa non 15 ngày tuổi đã xử lý với điều kiện hạn và mặn trong 2, 4, 6, 12, 24 đóng gói trong λ phage.
Hạt lúa PB1 và hạt thuốc lá Nicotiana tabacum cv. Petit Havana do Trung
tâm Kỹ thuật di truyền Công nghệ sinh học Quốc tế (Ấn Độ) cung cấp.
2.1.2. Chủng vi sinh vật
Vi khuẩn E. coli chủng DH5α đƣợc mua từ hãng Fermentas (Mỹ); vi khuẩn
E. coli chủng XLOR và XL1-Blue MRF đƣợc mua từ Công ty Agilent Technologies
(Mỹ); vi khuẩn E. coli chủng Rosetta (DE3) khả biến đƣợc mua từ Công ty Merck
Millipore (Mỹ); vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA4404 khả biến đƣợc mua từ Công ty Clontech Laboratories (Mỹ).
Nấm men Saccharomyces cerevisiae chủng YM4271 và AH109 mang các
đột biến gen tổng hợp Histidine (HIS3), Adenine (ADE2) và Galactosidase (gal)
đƣợc mua từ Công ty Clontech Laboratories (Mỹ); chủng phage “trợ giúp” (ExAssist interference - resistant helper phage) đƣợc mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ).
2.1.3. Vector và oligonucleotide
Các vector pLacZi/JRC0332, pLacZi/JRC0528, pLacZi/JRC2606, pHISi/ JRC0332, pHISi/JRC0528, pHISi/JRC2606 do nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp) thiết kế và cung cấp; vector YEpGAP, pBI-Lip9, pBI-Ubi do nhóm nghiên cứu của Kazuko Yamaguchi-Shinozaki (Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Nông nghiệp Quốc tế, Nhật Bản) thiết kế và cung cấp; các vector pAD-GAL4, pGBKT7 đƣợc mua từ Công ty Clontech Laboratories (Mỹ); vector pET28a đƣợc mua từ hãng Novagen (Mỹ), vector pRT101 do nhóm nghiên cứu của Reinhard Topfer thiết kế [111] và đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế (Ấn Độ); vector pCAMBIA1301 đƣợc mua từ Công
ty Marker Gene Technologies (Mỹ); vector pGEM-T mạch thẳng có đầu T đƣợc đóng gói kèm trong bộ kit pGEM®-T Easy Vector Systems của hãng Promega.
Các cặp oligonucleotide (Bảng 2.1) sử dụng làm mồi cho PCR dò cho thí nghiệm lai RNA đƣợc thiết kế dựa trên các trình tự đã đƣợc cơng bố trên GenBank và đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ).
Bảng 2.1: Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu.
Tên mồi Trình tự Gen/vector
AD-Fw 5’-GCACAGTTGAAGTGAACTTGC-3’ pAD-GAL4
AD-Rv 5’-AGGGATGTTTAATACCACTAC-3’ pAD-GAL4
BD-Fw 5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’ pGBKT7
BD-Rv 5’- AGATGGTGCACGATGCACAG-3’ pGBKT7
LAC-Fw 5’-TCCTTCTGTTCGGAGATTACCGAATC-3’ pLacZi
LAC -Rv 5’-ATGCTACAAAGGACCTAATGTATAAGG-3’ pLacZi
HIS-Fw 5’-GGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGC-3’ pHISi
HIS-Rv 5’- CGCTTTACTAGGGCTTTCTGCTCTGTCA-3’ pHISi
EcoRI-NLI-Fw 5’-GAATTCATGCCAGCACTGAGGATG-3’ OsNLI-IF
XhoI-NLI-Rv 5’-CTCGAGTTATTGGAAAATCTCAGC-3’ OsNLI-IF
NLI-SmaI-Fw 5’-GGGATGCCAGCACTGAGGATG-3’ OsNLI-IF
NLI-SmaI-Rv 5’-GGGTTATTGGAAAATCTCAGC-3’ OsNLI-IF
NLI-RT-Fw 5’-TTCATTCGACCACACAG-3’ OsNLI-IF
NLI-RT-Rv 5’-TGGATCCAAGATGTCAAGC-3’ OsNLI-IF
T7-Pro 5’-AATACGACTCACTATAG-3’ pGEM-T
SP6-Pro 5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’ pGEM-T
T7-Ter 5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’ pET28a
35S-Fw 5’-CCC ACT ATC CTT CGC AA-3’ 35S
Lip9-Fw 5’-GCGAATAGTTCTTGCTGATC-3’ Lip9
Ubi-Fw 5’-CCCTGCCTTCATACGCTATT-3’ Ubiquitin
NosT-Fw 5’-AGACCGGCAACAGGATTCAA-3’ Nos
GUS-Fw 5’-ATGGTAGAT CTGAGGGTAAA-3’ GUS
GUS-Rv 5’- TCACACGTGGTG GTGGTGGT-3’ GUS
GUS-t-Rv 5’-CAGTCAACAGACGCGTGG-3’ GUS
NLI-t-Fw 5’-CGTTATTTCCGGGAGTCA-3’ OsNLI-IF
Actin-Fw 5’-TGATGGTGTCAGCCACACT-3’ Actin
2.1.4. Hóa chất
Các loại enzyme giới hạn, DNA T4 ligase, Dream Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, thang chuẩn DNA 1 kb và bộ kit tinh sạch DNA plasmid GeneJET Plasmid Miniprep Kit đƣợc mua hãng Fermentas (Mỹ). Bộ kit sinh tổng hợp cDNA và Real-time PCR đƣợc mua ông ty Agilent Technologies (Mỹ). Các hóa chất sử dụng để tinh sạch RNA/DNA/protein và các loại kháng sinh đƣợc mua từ hãng Invitrogen. Các hóa chất cơ bản sử dụng cho sinh học phân tử đƣợc mua Công ty Sigma và Merk ( ) đều đạt độ tinh khiết cần thiết cho sinh học phân tử.
2.1.5. Thiết bị
Máy PCR 9700 của hãng Perkin Elmer; hệ thống điện di DNA và protein của hãng Biorad; máy ly tâm Universal 30RF của hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus; máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader của hãng UVItec; hệ thống máy Real-time PCR System 7500 của Công ty Applied Biosystem ).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xử lý mẫu thực vật
2.2.1.1. Xử lý cây lúa với các điều kiện stress giả định
Thí nghiệm xử lý stress giả định đối với cây lúa non đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Qin và nhóm nghiên cứu [95]. Hạt lúa đƣợc ủ trong nƣớc ở 37o
C trong 2 ngày; hạt nảy mầm đƣợc chuyển sang trồng trong dung dịch MS ở điều kiện 28oC trong 2 tuần. Đối với thí nghiệm xử lý stress nhiệt độ, cây đƣợc giữ trong điều kiện 4oC (xử lý lạnh) và 42oC (xử lý nhiệt độ cao). Đối với thí nghiệm xử lý hạn và mặn, rễ cây lúa non đƣợc nhúng vào dung dịch MS có chứa PEG 20% (xử lý hạn) và dung dịch MS có chứa NaCl 200 mM (xử lý hạn). Để tạo điều kiện stress khô hạn và mất nƣớc giả định, cây lúa non đƣợc nhấc ra khỏi dung dịch nuôi cấy, đặt trên giấy thấm và giữ trong tủ cấy. Sau mỗi khoảng thời gian khảo sát (0,5; 1; 2; 6; 12 và 24
), mẫu lúa đƣợc nhúng ngay vào nitơ lỏng vào bảo quản tới khi tách chiết RNA.
2.2.1.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen
Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Dubouzet và Tran [36, 113].
Cây thuốc lá: Hạt thuốc lá đƣợc cho nảy mầm trên mơi trƣờng MS khơng có
chất kháng sinh (đối với cây đối chứng khơng chuyển gen) và có chứa Hygromycin 50 mg/l (đối với cây chuyển gen). Cây non ở giai đoạn 2 lá non đƣợc chuyển sang chậu đất và trồng trong điều kiện nhà kính trong 2 tuần. Các mẫu cây đƣợc xử lý stress hạn giả định bằng cách ngừng tƣới nƣớc trong 1 tháng, sau đó tƣới nƣớc trở lại bình thƣờng (Hình 2.1). Sau 2 tuần, số cây phục hồi sinh trƣởng đƣợc đếm và ghi lại.
Hình 2.1: Mơ hình minh họa thí nghiệm xử lý stress hạn cây chuyển gen.
Cây lúa: Hạt lúa đƣợc cho nảy mầm trên môi trƣờng MS khơng có chất
kháng sinh (đối với cây đối chứng khơng chuyển gen) và có chứa Hygromycin 100 mg/l (đối với cây chuyển gen). Sau 7 ngày, cây lúa non đƣợc chuyển sang chậu đất và trồng đến khi cây lúa đạt trạng thái 3 lá. Các mẫu thí nghiệm đƣợc trồng trong điều kiện khơng tƣới nƣớc liên tục đến khi mẫu đối chứng (cây không chuyển gen) có biểu hiện héo chết không thể phục hồi (2 tuần) hoặc đến khi chỉ cịn một mẫu duy nhất vẫn có biểu hiện sống sót (3 tuần) thì tƣới nƣớc trở lại bình thƣờng. Sau 3 ngày, số cây phục hồi sinh trƣởng đƣợc đếm và ghi lại.
2.2.2. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA
2.2.2.1. Tách chiết DNA plasmid
DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Một khuẩn lạc đƣợc nuôi lắc trong 5 ml LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh thích hợp với tốc độ 220 vịng/phút ở 37°C qua đêm. Tế bào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6.000 vịng/phút trong 10 phút, ở 4oC, sau đó đƣợc hịa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung RNase A. 250 µl đệm P2 (Lysis solution) đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào. Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó đƣợc trung hịa bởi 350 µl đệm P3
(Neutralization solution). Ống đƣợc ly tâm với vận tốc 13.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung vào cột; cột đƣợc ly tâm 30 – 60 giây. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa. 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica; cột đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm cột với vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Mẫu DNA plasmid tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C.
DNA plasmid đƣợc tinh sạch từ tế bào nấm men theo quy trình hƣớng dẫn của hãng Clontech [27]. Một khuẩn lạc nấm men (kích thƣớc 2 – 4 mm) đƣợc ni lắc với tốc độ 250 vịng/phút trong mơi trƣờng YPD ở 30oC qua đêm. Tế bào đƣợc thu lại bằng cách ly tâm dịch ni ở tốc độ 14.000 vịng/phút trong 5 phút và đƣợc hòa trở lại trong 200 µl đệm TE (pH 7,0). 200 µl hỗn hợp phenol-chloroform- isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) và 0,1 g hạt thủy tinh đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào. Hỗn hợp đƣợc đƣợc ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc bổ sung thêm 8 µl CH3COONH4 10 M và 500 µl ethanol 100%. Hỗn hợp đƣợc ủ ở -70oC trong 1 giờ, sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 10 phút. Kết tủa DNA đƣợc làm khơ và hịa lại trong 50 µl đệm TE. Mẫu DNA plasmid tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C.
2.2.2.2. Tách chiết RNA từ mô thực vật
RNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá lúa non theo quy trình hƣớng dẫn của hãng Invitrogen. Mẫu thực vật tƣơi đƣợc thu và bảo quản trong N2 lỏng cho tới khi tách chiết. 100 mg mẫu mô thực vật đƣợc nghiền thành bột mịn trong N2 lỏng và chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó, 1 ml Trizol đƣợc bổ sung vào ống; ống đƣợc đảo đều và ủ trên đá trong 5 phút. Tiếp theo, 200 µl chloroform đƣợc bổ sung vào hỗn hợp; ống đƣợc ủ trên đá trong 15 phút. Hỗn hợp đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút, ở 4oC. Dịch nổi đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. 500 µl isopropanol đƣợc bổ sung vào dung dịch; ống đƣợc ủ trên đá trong 15 phút. Kết tủa RNA đƣợc thu lại bằng cách ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút, trong 15 phút, ở 4oC và đƣợc rửa lại trong 1 ml ethanol 70%. Ống đƣợc
lắc mạnh trong 15 giây, sau đó đƣợc ly tâm với tốc độ 13.000 vịng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Kết tủa đƣợc thu lại và làm khô trong 1 giờ. Kết tủa RNA cuối cùng đƣợc hịa tan lại trong 50 µl dung dịch DEPC 0,2% và bảo quản ở nhiệt độ -80o
C.
2.2.2.3. Điện di DNA/RNA trên gel agarose
DNA/RNA trong mẫu thí nghiệm đƣợc phát hiện và định lƣợng tƣơng đối bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose và nhuộm Ethidium bromide (EtBr) theo phƣơng pháp của Sambrook [102].
Điện di DNA: 1,0 g agarose đƣợc đun nóng trong 100 ml đệm TAE và đúc
vào khuôn. Hỗn hợp mẫu gồm 5 l mẫu DNA đƣợc trộn với 1 l đệm mẫu có chứa bromophenol xanh, xylene cyanol và EtBr (50 g/ l) đƣợc tra vào các giếng trên bản gel. Mẫu đƣợc điện di với hiệu điện thế 10 V/cm gel. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại, các băng DNA gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel đen.
Điện di RNA: 1,8 g agarose đƣợc đun nóng để hịa tan trong 170 ml H2O, sau đó làm mát về 65oC. 10 ml formaldehyde (37%) và 20 ml đệm MOPS 10 X đƣợc bổ sung vào dung dịch; hỗn hợp đƣợc lắc đều và đổ vào khuôn đúc gel. 10 µl mẫu RNA đƣợc trộn với 20 µl đệm mẫu RNA (có chứa formamide, formaldehyde và EtBr); hỗn hợp mẫu đƣợc ủ ở 65oC trong 5 phút và làm mát trên đá. Trƣớc khi tra mẫu điện di, gel đƣợc điện di khởi động ở hiệu điện thế 5 V/cm trong 5 phút. Mẫu đƣợc trộn với 2 µl đệm có chứa chất màu chỉ thị bromophenol xanh, sau đó đƣợc tra vào giếng và điện di với hiệu điện thế 100 V trong 10 phút và 65 V trong 90 phút. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
2.2.2.4. Đánh giá mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Real-time PCR
Phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc thực hiện theo quy trình của hãng Stratagene, sử dụng các mẫu RNA tinh sạch đã đƣợc bảo quản ở -80oC. 2,5 µg mẫu RNA tinh sạch đƣợc trộn với 0,8 µl dNTP (100 mM), 1 µl oligo dT (nồng độ 0,5 µg/µl), 2 µl đệm 10 X trong ống PCR thể tích 200 µl. H2O khử RNase đƣợc bổ sung vào hỗn hợp để đạt tổng thể tích là 16,5 µl. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 65oC trong 5 phút,
sau đó đƣợc làm mát và để ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. 0,5 µl chất ức chế RNase, 2 µl DDT 100 mM và 1 µl Reverse Transcriptase đƣợc thêm vào trong ống phản ứng. Ống đƣợc ủ ở 42oC trong 60 phút để phản ứng tổng hợp cDNA xảy ra. Sản phẩm phản ứng đƣợc bảo quản ở nhiệt độ -80oC.
Mẫu cDNA đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng Real-time PCR với cặp mồi NLI-RT-Fw/NLI-RT-Rv (Bảng 2.1). Gen actin đƣợc sử dụng làm gen nội chuẩn. Thành phần của phản ứng bao gồm: 5 µl hỗn hợp PCR SYBR Green Master Mix 2 X; 0,25 µl mỗi loại mồi (10 pmol); 1 µl cDNA khn; 0,15 µl chất nội chuẩn tín hiệu huỳnh quang ROX; 3,35 µl H2O. Phản ứng Real-time PCR đƣợc thực hiện bằng hệ thống máy Real-time PCR System 7500 của hãng Life Technologies theo quy trình của nhà sản xuất.
Mức độ biểu hiện của gen đích trong các mẫu cây đƣợc tính tốn dựa trên giá trị Ct thu đƣợc theo cơng thức của Jain và nhóm nghiên cứu [49]:
Biểu hiện của gen đích trong mẫu xét nghiệm = 2-∆∆Ct lần so với mẫu đối chứng
(Trong đó: ∆∆Ct = ∆Ct mẫu - ∆Ct đối chứng ∆Ct mẫu = Ct mẫu - Ct gen nội chuẩn ∆Ct đối chứng = Ct đối chứng - Ct gen nội chuẩn).
2.2.3. Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T
Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc nhân bản từ thƣ viện cDNA của lúa bằng kỹ thuật
PCR [102], sử dụng cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv (Bảng 2.1). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 0,5 µl DNA khn; 1 µl mỗi loại mồi; 2,5 µl đệm Taq
polymerase 10 X; 2,5 µl dNTP 2 mM; 1 µl Taq polymerase; 17,5 µl H2O cất khử trùng khử ion. Phản ứng đƣợc thực hiện 35 chu kỳ: biến tính DNA ở 95oC – 30 giây, gắn mồi ở 55oC – 30 giây và kéo dài chuỗi ở 72oC – 1 phút. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình hƣớng dẫn. Băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác từ gel agarose và đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (Binding buffer)
đƣợc bổ sung vào ống (1 µl đệm ~ 1 mg gel); ống đƣợc ủ ở 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hồn tồn. Dung dịch gel agarose đã hịa tan đƣợc chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm với tốc độ 10.000 vịng/phút trong 1 phút. 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung vào cột và ly tâm trong 1 phút ở vận tốc 10.000 vòng/phút. Bƣớc rửa cột đƣợc lặp lại một lần nữa. 100 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa lớp màng silica của cột. DNA đƣợc thu bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút. Mẫu DNA tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose (mục 2.2.2.3) và đƣợc bảo quản ở -20°C.
Sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen OsNLI-IF đƣợc nhân dòng vào vector
pGEM-T theo quy trình hƣớng dẫn đi kèm bộ kit (Promega). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 1 µl sản phẩm PCR tinh sạch, 1 µl vector pGEM-T mạch thẳng (50 ng), 5 µl đệm 2 X, 1 µl T4 DNA Ligase (3 U/µl) và 2 µl H2O cất khử trùng, khử ion. Hỗn hợp phản ứng ghép nối DNA đƣợc ủ ở 4oC qua đêm.
Sản phẩm phản ứng ghép nối đoạn gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α. Tế bào E. coli DH5α khả biến (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) đƣợc làm tan trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, hỗn hợp phản ứng ghép nối đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào và đƣợc ủ trên đá trong 20 phút. Tế bào đƣợc sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó đƣợc chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút. Tiếp theo, 450 µl LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp; tế bào đƣợc ủ ở 37°C trong 20 phút trƣớc khi đƣợc nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong 30 phút. Hỗn hợp tế bào đƣợc cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB