Ghi chú: (A) Kháng thể tinh sạch qua cột sắc ký Protein A - Sepharose được điện di trên
gel SDS-PAGE 12%; giếng 1: phân đoạn rửa giải bằng đệm glycine-HCl; giếng 2: phân đoạn rửa cột cuối. (B) Protein OsNLI-IF tái tổ hợp được phát hiện bằng kháng thể IgG
tinh sạch pha loãng 1:10.000; giếng 1: dịch chiết tế bào E. coli; giếng 2: OsNLI-IF tái tổ hợp tinh sạch. Giếng M: thang chuẩn protein.
Sự có mặt của protein OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá chuyển gen T1 đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch với kháng thể kháng OsNLI-IF đã tạo đƣợc ở thí nghiệm trên. Các mẫu cây thuốc lá chuyển gen T1 35S:OsNLI-IF (dòng TL1, TL3, TL4, TL7, TL8 và TL10) kháng Hygromycin đƣợc nghiền trong đệm PBS và pha loãng về cùng một chỉ số OD280 để chuẩn hóa lƣợng protein tổng số và sử dụng cho thí nghiệm lai thẩm tách miễn dịch. Trong thí nghiệm này, mẫu cây thuốc lá T1 đƣợc chuyển cấu trúc khơng mang gen đích pCAMBIA1301 (dịng ĐC2) và mẫu cây thuốc lá không chuyển gen đƣợc phân tích đồng thời nhƣ những mẫu đối chứng âm; mẫu protein OsNLI-IF tái tổ hợp tinh sạch đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng.
Hình 3.30: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các dịng thuốc lá chuyển gen T1
Ghi chú: (A) Protein OsNLI-IF trong dịch chiết protein tổng số của các dòng thuốc lá
được phát hiện bằng kháng thể đa dòng đặc hiệu (pha loãng 1:2000); giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1 – 3 và 5 – 7: dòng TL1, TL3, TL4, TL7, TL8, TL10; giếng 4: OsNLI-IF tái tổ hợp (P); giếng 8: dòng ĐC8 (V); giếng 9: cây thuốc lá không chuyển gen (WT). (B) Đồ thị so sánh hàm lượng protein OsNLI-IF tương quan giữa các dịng thuốc lá; hàm lượng OsNLI-IF của dịng TL10 có giá trị bằng 1; giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm trên 3 cây khác nhau.
Kết quả lai thẩm tách miễn dịch cho thấy có 5 trong số 6 dòng thuốc lá chuyển gen đƣợc kiểm tra (TL1, TL3, TL7, TL8 và TL10) có biểu hiệ
sự 1 băng protein 52 kDa (Hình 3.30A, giếng 1, 2, 5, 6, và 7) tƣơng tự mẫu đối chứng dƣơng sử dụng protein OsNLI-IF tái tổ hợp (Hình 3.30A, giếng 4). Ngƣợc lại, cả 3 cây T1 thuộc dòng TL4 và 3 cây thuộc hai dòng đối chứng (chuyển cấu trúc pCAMBIA1301 và không chuyển gen) đều cho kết quả âm tính. Sử dụng phần mềm ImageJ, mức độ biểu hiện protein OsNLI-IF tƣơng quan giữa các dòng thuốc lá chuyển gen đã đƣợc xác định (Hình 3.30B). Kết quả so sánh cho thấy mức độ biểu hiện của gen đích OsNLI-IF có sự khác biệt đáng kể giữa các dòng thuốc lá chuyển gen. Cụ thể, hàm lƣợng protein OsNLI-IF cao nhất đƣợc phát hiện trong các cây thuộc hai dòng TL1 và TL8; hai dòng TL3 và TL7 có mức độ biểu hiện protein đích ở mức vừa phải; dịng TL10 có mức độ tích lũy OsNLI-IF thấp nhất; dòng TL4 hồn tồn khơng biểu hiện protein đích. Nhƣ vậy, bằng phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens, chúng tôi đã
chuyển thành công cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào cây thuốc lá và thu đƣợc các dòng thuốc lá chuyển gen T1 có biểu hiện protein đích OsNLI-IF.
Các nghiên cứu chuyển gen thực vật nói chung và nghiên cứu gen mã hố nhân tố phiên mã nói riêng đƣợc thực hiện trƣớc đây thƣờng sử dụng phƣơng pháp phân tích biểu hiện của gen đích ở mức độ mRNA, sau đó là phân tích sự biểu hiện tính trạng liên quan tới gen chuyển [44, 73, 86, 112, 113]. Một vài nghiên cứu cũng đã sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện sự biểu hiện của protein đích bằng phƣơng pháp dựa trên liên kết kháng nguyên-kháng thể. Ví dụ, Liu và nhóm nghiên cứu đã xác định sự biểu hiện của gen TiMYB2R-1 trong cây lúa mì chuyển gen bằng cả hai phƣơng pháp RT-PCR và lai thẩm tách miễn dịch [78]. Trong nghiên cứu của Wang và nhóm nghiên cứu, mức độ tích luỹ protein TaWRKY10 (lúa mì) trong các dịng thuốc lá chuyển gen đã đƣợc chứng minh bằng phƣơng pháp lai thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đa dòng đặc hiệu [118]. Để phát hiện sự biểu hiện của nhân tố phiên mã RAP2.1 trong cây A. thaliana chuyển gen, Dong và nhóm nghiên cứu đã thiết kế vector biểu hiện protein dung hợp MYC:RAP2.1 và sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng protein MYC [34]. Trong nghiên cứu này, bằng phƣơng pháp lai thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đa dòng kháng đặc hiệu protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, chúng tôi đã xác định đƣợc sự tích luỹ protein đích OsNLI-IF trong các dịng thuốc lá chuyển gen với mức độ khác nhau. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Day và nhóm nghiên cứu trƣớc đây [32], trong đó các tác giả đã chứng minh vị trí của cấu trúc biểu hiện gen đích trên NST gây ảnh hƣởng đáng kể tới mức độ biểu hiện gen đích, dẫn tới sự tích luỹ protein đích khơng giống nhau giữa các dòng cây chuyển gen khác nhau.
3.4.2.5. Đánh giá khả năng sinh trưởng và chịu hạn của các dòng thuốc lá T1
Để xác định ảnh hƣởng của sự biểu hiện liên tục gen mã hóa OsNLI-IF đối với khả năng sinh trƣởng của cây thuốc lá chuyển gen, hạt của 3 dòng thuốc lá đại diện cho 3 mức độ biểu hiện gen khác nhau (TL1 – biểu hiện cao, TL10 – biểu hiện thấp và TL4 – không biểu hiện) đã đƣợc lựa chọn để tiếp tục phân tích, đánh giá kiểu hình. Hạt thuốc lá đƣợc cho nảy mầm trên mơi trƣờng MS có Hygromycin, sau đó đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR và lai thẩm tách miễn dịch để khẳng định sự có mặt và biểu hiện của gen đích. Các cây thuốc lá có kết quả kiểm tra dƣơng
tính đƣợc chuyển sang trồng trong chậu đất và theo dõi sinh trƣởng. Dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc pCAMBIA1301 (dòng ĐC2) và dịng thuốc lá khơng chuyển gen cũng đƣợc khảo sát đồng thời để làm đối chứng âm trong thí nghiệm này.
Hình 3.31: Khả năng sinh trƣởng của các dòng thuốc lá chuyển gen T1
Ghi chú: Hình thái của các dịng thuốc lá sinh trưởng ở giai đoạn 4 tuần tuổi. (WT) cây
thuốc lá dại; (V) dòng thuốc lá mang cấu trúc pCAMBIA1301; (TL1, TL4, TL10) dòng thuốc lá mang cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos.
Kết quả quan sát các cây thuốc lá ở giai đoạn 4 tuần tuổi cho thấy khơng có sự khác biệt đáng kể về hình thái và tốc độ sinh trƣởng giữa cây thuốc lá đối chứng khơng chuyển gen (Hình 3.31, dịng WT) và cây thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc khơng mang gen đích pCAMBIA1301 (Hình 3.31, dịng V). Điều này chứng tỏ việc chuyển cấu trúc biểu hiện gen trên vector pCAMBIA1301 vào cây thuốc lá không gây ảnh hƣởng tới khả năng sinh trƣởng của cây. Đối với ba dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF, mặc dù hình thái cây không xuất hiện
những đặc điểm bất thƣờng, tốc độ sinh trƣởng của ba dịng cây chuyển gen này có sự khác biệt đáng kể khi đƣợc so sánh với nhau và với hai dòng thuốc lá đối chứng. Quan sát này cho thấy tốc độ sinh trƣởng của cây chuyển gen tỉ lệ nghịch với mức độ biểu hiện của gen OsNLI-IF. Cụ thể, dịng thuốc lá tích lũy protein OsNLI-IF ở
mức cao nhất (dịng TL1) có tốc độ sinh trƣởng chậm nhất, dịng thuốc lá biểu hiện protein OsNLI-IF ở mức thấp (dịng TL10) hoặc khơng biểu hiện protein OsNLI-IF (dịng TL4) có tốc độ sinh trƣởng nhanh hơn và khơng khác biệt lớn so với hai dịng đối chứng (Hình 3.31, dịng TL1, TL4 và TL10). Kết quả này chứng tỏ sự biểu hiện của gen OsNLI-IF đã gây ảnh hƣởng tới khả năng sinh trƣởng của cây thuốc lá
chuyển gen và mức độ tích lũy protein OsNLI-IF trong mơ càng cao sẽ dẫn tới cây sinh trƣởng càng chậm trong điều kiện gieo trồng bình thƣờng (khơng có stress).
Promoter 35S là promoter đƣợc sử dụng phổ biến nhất để điều khiển sự biểu
hiện của gen chuyển trong nghiên cứu chuyển gen thực vật [87]. Tuy nhiên, sự biểu hiện liên tục của một gen, đặc biệt là những gen chức năng hay gen mã hoá nhân tố phiên mã đáp ứng stress thƣờng gây ảnh hƣởng tới sinh trƣởng của cây chuyển gen. Ví dụ, các dịng cây chuyển gen biểu hiện liên tục OsNAC6/SNAC2, OsDREB1A, OsDREB1B, AtDREB1A hay AtDREB1B đều sinh trƣởng chậm và giảm sản lƣợng đáng kể trong điều kiện bình thƣờng so với cây đối chứng khơng chuyển gen [48, 57, 86]. Thông thƣờng, sự biểu hiện liên tục của các gen liên quan tới q trình truyền tín hiệu ABA có thể làm giảm đáng kể khả năng sinh trƣởng của cây do ABA đóng vai trị trung tâm điều hoà quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật [108]. Maruyama và nhóm nghiên cứu khi nghiên cứu nguyên nhân dẫn tới sự suy giảm sinh trƣởng của các dòng cây chuyển gen mang cấu trúc 35S:DREB1A đã phát hiện ra sự biểu hiện của gen chuyển đã làm tăng cƣờng biểu hiện một số nhân tố phiên mã khác có ảnh hƣởng ức chế quá trình quang hợp và trao đổi carbohydrate [80]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh đƣợc sự biểu hiện liên tục của gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF dƣới sự điểu khiển của promoter 35S cũng làm giảm tốc độ sinh trƣởng của cây thuốc lá chuyển gen, ít nhất là ở giai đoạn cây non 4 tuần tuổi.
Hình 3.32: Khả năng chống chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen
Ghi chú: Cây thuốc lá 4 tuần tuổi được trồng để so sánh hình thái trong điều kiện tưới
nước liên tục (bình thường) và ngừng tưới nước (hạn) trong 1 tháng. Ảnh được chụp tại thời điểm 3 ngày sau khi tưới nước trở lại. Số cây phục hồi sau xử lý hạn được ghi lại. (WT) cây thuốc lá dại; (TL1, TL10) dòng thuốc lá mang cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos.
Các nhân tố phiên mã tƣơng tác với promoter của gen biểu hiện cảm ứng với stress môi trƣờng thƣờng đóng vai trị nhất định trong mạng lƣới điều hoà hoạt động gen đáp ứng stress của tế bào thực vật. Một số gen mã hóa các nhân tố phiên mã này đã đƣợc chứng minh giúp tăng sức chống chịu của cây với điều kiện bất lợi khi đƣợc biểu hiện tăng cƣờng trong cây chuyển gen mơ hình [77, 78, 94, 113]. Để đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện tăng cƣờng protein OsNLI-IF của lúa, các cây thuốc lá chuyển gen T1 đƣợc chúng tôi trồng trong điều kiện stress hạn giả định (khơng tƣới nƣớc) trong một tháng, sau đó tƣới nƣớc trở lại và quan sát khả năng phục hồi (Hình 3.32).
Bảng 3.8: Tỉ lệ phục hồi sau xử lý stress hạn các dòng thuốc lá.
Dòng thuốc lá Cấu trúc biểu hiện gen
Tỉ lệ cây sống sót Tƣới nƣớc1
Khơng tƣới nƣớc2
Đối chứng Không chuyển gen 35/35
(100%) 6/36 (16%) ĐC2 pCAMBIA1301 36/36 (100%) 3/36 (8%) TL1 35S:OsNLI-IF 35/36 (97%) 20/36 `(56%) TL4 35S:OsNLI-IF 36/36 (100%) 8/36 (22%) TL10 35S:OsNLI-IF 36/36 (100%) 27/36 (75%) (1)
Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và tưới nước hàng ngày.
(2)
Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và không tưới nước liên tục trong 1 tháng, sau đó tưới nước trở lại liên tục trong 3 ngày.
Kết quả thể hiệ 3.32 và bảng 3.8 cho thấy dịng thuốc lá TL10 biểu hiện protein đích OsNLI-IF ở mức độ thấp có khả năng chống chịu hạn cao nhất với tỉ lệ cây phục hồi sau stress hạn chiếm 75% tổng số cây đƣợc kiểm tra. Khả năng chịu hạn của dịng thuốc lá TL1 (có gen OsNLI-IF biểu hiện mạnh) thấp hơn so với dòng thuốc lá TL10, với 20/36 cây phục hồi sau thí nghiệm xử lý hạn (56%). Đặc biệt, tỉ lệ sống sót của các cây thuốc lá có biểu hiện protein OsNLI-IF cao hơn rõ rệt so với dòng đối chứng khơng chuyển gen (16%) cũng nhƣ dịng ĐC2 đƣợc chuyển
cấu trúc pCAMBIA1301 không mang gen (8%) hay dòng TL4 đƣợc chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF nhƣng khơng biểu hiện gen đích (8%).
Cho đến nay đã có một số lƣợng lớn các gen mã hóa nhân tố phiên mã tham gia vào mạng lƣới điều hòa hoạt động gen đáp ứng điều kiện môi trƣờng bất lợi đƣợc phát hiện và phân lập ở lúa. Nhiều gen trong số này khi đƣợc biểu hiện liên tục dƣới sự điều khiển của một promoter hoạt động mạnh có thể tăng cƣờng khả năng chống chịu stress phi sinh học của cây chuyển gen hai lá mầm. Ví dụ, sự biểu hiện của ONAC063, OsWRKY45 hay OsWRKY72 (của lúa) dƣới sự điều khiển của
promoter 35S làm tăng khả năng chịu hạn, mặn và nhiệt độ cao của cây A. thaliana chuyển gen [25, 128]. Tƣơng tự, cây bông đƣợc chuyển gen SNAC1 (của lúa) hay cây thuốc lá đƣợc chuyển gen TaWRKY10 (của lúa mì) cũng thể hiện tính chịu hạn và mặn cao hơn so với cây không chuyển gen [75, 118]. Các thực tế này cho thấy trong tế bào của các loài thực vật một lá mầm và hai lá mầm có thể tồn tại nhiều con đƣờng điều hồ biểu hiện gen đáp ứng với điều kiện stress tƣơng tự nhau, chứng tỏ cơ chế điều hồ đáp ứng chống chịu stress có tính bảo thủ cao giữa hai nhóm thực vật này. Dubouzet và nhóm nghiên cứu đã chứng minh sự biểu hiện tăng cƣờng
OsDREB1A (của lúa) trong cây A. thaliana chuyển gen đã hoạt hóa sự biểu hiện của
một loạt gen đích đƣợc điều hịa bởi nhân tố phiên mã DREB1A (của A. thaliana)
[36]. Kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu này đã ủng hộ thêm cho giả thuyết trên, các dòng thuốc lá biểu hiện gen OsNLI-IF (phân lập từ lúa) có tỉ lệ sống sót sau giai đoạn xử lý hạn cao hơn rõ rệt so với dịng khơng chuyển gen và dịng khơng biểu hiện gen đích (Hình 3.32). Mặc dù vẫn cần có những thí nghiệm phân tích sâu hơn để làm rõ cơ chế điều hoà của nhân tố phiên mã OsNLI-IF, kết quả thí nghiệm của chúng tơi đã bƣớc đầu chứng minh OsNLI-IF có tham gia vào quá trình đáp ứng chống chịu hạn của thực vật.
3.4.3. Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây lúa chuyển gen
3.4.3.1. Chuyển cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF vào lúa
Để nghiên cứu vai trò của nhân tố phiên mã OsNLI-IF trong đáp ứng chống chịu hạn của cây lúa, chúng tơi đã thực hiện thí nghiệm chuyển gen OsNLI-IF vào lúa.
Mơ sẹo hình thành từ hạt lúa đƣợc lần lƣợt chuyển các cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF (Ubi:OsNLI-IF, Lip9:OsNLI-IF, 35S:OsNLI-IF-S, 35S:OsNLI-IF-AS) và các cấu trúc
vector nhị phân khơng mang gen đích (pCAMBIA1301, pBI-Ubi, pBI-Lip9), sau đó đƣợc chọn lọc và tái sinh trên môi trƣờng nuôi cấy in vitro (Hình 3.33). Kết quả
chuyển nạp gen trình bày trong bảng 3.9 cho thấy tỉ lệ tái sinh của giống lúa Indica khá thấp, chỉ có 141 dịng lúa tái sinh từ 3.500 hạt đƣợc nuôi cấy tạo mô sẹo (đạt 4%). Sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen quan tâm trong các dòng lúa tái sinh đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu của từng cấu trúc (Bảng 3.9, Phụ lục 18). Kết quả thu đƣợc cho thấy có 138/141 dịng lúa tái sinh cho kết quả PCR dƣơng tính; chứng tỏ các cấu trúc biểu hiện gen đích đã đƣợc chuyển thành cơng vào lúa.
Hình 3.33: cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF vào lúa
Ghi chú: (A) Mơ sẹo hình thành từ phơi trưởng thành trên môi trường MS tạo mô sẹo. (B)
Đồng nuôi cấy mô sẹo và vi khuẩn Agrobacterim mang gen OsNLI-IF. (C) Mô sẹo trên môi trường chọn lọc có Hygromycin 50 mg/l và Cefotaxim 250 mg/l. (D) Mô sẹo trên môi trường tái sinh có Hygromycin 30 mg/l và Cefotaxim 250 mg/l. (E) Chồi tái sinh trên môi trường tái sinh. (F) Chồi lúa non trên môi trường tạo rễ.
Các cây lúa tái sinh hồn chỉnh mang gen đích đƣợc chuyển sang trồng trong chậu đất để thu hạt. Trong số các dòng lúa tái sinh đƣợc trồng trong chậu đất, chỉ có 7/23 dịng mang cấu trúc Lip9:OsNLI-IF, 38/49 mang cấu trúc Ubi:OsNLI-IF, 1/7
dòng mang cấu trúc pBI-Ubi và 3/19 dòng mang cấu trúc pCAMBIA1301 có khả năng sinh trƣởng bình thƣờng trong điều kiện nhà kính; các dịng cây cây chuyển gen còn lại đều chết ở các giai đoạn khác nhau. Tuy nhiên, dù sinh trƣởng bình
thƣờng và có kiểu hình khơng khác biệt so với cây lúa đối chứng không chuyển gen, đa số các dịng lúa chuyển gen khơng thể trổ bơng và kết hạt bình thƣờng; chỉ có 16 dịng đƣợc chuyển cấu trúc Ubi:OsNLI-IF có khả năng kết hạt bình thƣờng, nảy
mầm thành cây chuyển gen thế hệ T1 (Bảng 3.9).
Bảng 3.9: Kết quả chuyển gen vào lúa thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Giai đoạn
Dịng cây chuyển gen T0
Lip9: