Thành phần Thể tích (ml)
Gel tách (12%) Gel cô (4%)
Acrylamide 30% 2,0 0,17
Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) 1,3 -
Tris-HCl/SDS 1 M (pH 6,8) - 0,13
SDS 10 % 0,05 0,01
Ammonium persulfat (APS) 10% 0,05 0,01
Tetra methyl ethylene diamin (TEMED) 0,002 0,001
H2O 1,6 0,68
Protein OsNLI-IF tái tổ hợp trong mẫu dịch chiết và mẫu tinh sạch đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch (Western blotting) [102], sử dụng kháng kháng thể sơ cấp anti – His-tag. Mẫu protein sau khi đã phân tách bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS-PAGE đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose bằng phƣơng pháp điện chuyển trong đệm Tris-glycine có methanol 20%. Màng đƣợc cố định bằng cách lắc nhẹ (30 phút - 1 giờ) trong dung dịch BSA 1% đƣợc pha bằng đệm TBS (Tris 10 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM) ở 37oC. Sau đó, màng đƣợc tráng rửa (3 lần) bằng đệm TBS. Tiếp theo, màng đƣợc ủ với kháng thể sơ cấp trong thời gian 1 giờ, ở 37oC. Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng đƣợc loại bỏ khỏi màng bằng cách tráng rửa màng trong đệm TBS. Sau đó, màng tiếp tục đƣợc ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn phosphatase kiềm. Các băng protein đƣợc hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p-nitro blue tetrazolium chloridel 5- bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha trong đệm TBS pH 9,0 có MgCl2 5 mM. Phản ứng đƣợc ngừng bằng cách bổ sung đệm TBS có chứa EDTA 20 mM (đến khi các băng protein hiện rõ màu).
2.2.6.2. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột
Quy trình gây miễn dịch đƣợc tiến hành theo cơng bố của Amero và nhóm nghiên cứu [15]. Mẫu protein OsNLI-IF tinh sạch đƣợc điện di trên gel SDS-PAGE 12%; băng protein 52 kDa đƣợc cắt chính xác và nghiền trong hỗn hợp gồm 200 µl tá dƣợc và 200 µl đệm PBS (Kali photphate 50 mM, pH 7,25; NaCl 150 mM). Hỗn hợp đƣợc trộn đến khi tạo thành dạng nhũ tƣơng quánh (khoảng 45 phút) và đƣợc sử dụng để tiêm vào chuột ở vị trí phúc mạc bụng. Sau một tuần, chuột thí nghiệm đƣợc tiêm nhắc lại một lần. Sau ba tuần, kháng huyết thanh đƣợc thu bằng cách lấy toàn bộ máu chuột và ly tâm ở tốc độ 2.000 vòng/phút trong 5 phút (để loại hết các tế bào máu). Khả năng nhận biết protein OsNLI-IF tái tổ hợp của kháng huyết thanh đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch nhƣ đã trình bày ở trên.
Kháng thể IgG trong huyết thanh chuột đƣợc tinh sạch bằng cột sắc ký Protein A - Sepharose dựa trên khả năng liên kết đặc hiệu của protein A với vùng CH2 của chuỗi nặng kháng thể IgG [43]. Kháng huyết thanh (có chứa kháng thể mong muốn)
đƣợc chuẩn pH về giá trị 8,0 bằng cách thêm 0,1 thể tích đệm Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Gel Protein A - Sepharose sau khi cho trƣơng nở trong đệm PBS, pH 7,4 (đệm C), đƣợc nhồi vào cột (1 x 2 cm). Cột đƣợc cân bằng bằng cách cho 10 ml đệm Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 chảy qua. Kháng huyết thanh sau khi chuẩn về pH 8,0 đƣợc cho gắn lên cột. Các protein không hấp phụ trên gel (không gắn hoặc gắn không đặc hiệu) đƣợc rửa lần lƣợt bằng đệm Tris-HCl 100 mM và 10 mM, pH 8,0. Phần hấp thụ (gắn đặc hiệu) đƣợc đẩy ra bằng đệm glycine-HCl 100 mM, pH 3,0. Dịch đẩy nhanh chóng đƣợc trung hịa về pH 8,0 bằng cách cho thêm 1/10 thể tích đệm Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Các phân đoạn tách ra qua cột đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS-PAGE và lai thẩm tách miễn dịch tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở trên.
2.2.7. Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsNLI-IF
2.2.7.1. Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens [119]
Tế bào A. tumefaciens LBA4404 khả biến (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) đƣợc làm tan trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, 1 µg DNA plasmid đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 15 phút để tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào, sau đó đƣợc chuyển sang ủ trong N2 lỏng trong 5 phút. Tế bào đƣợc sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 37oC trong 5 phút. Ống tế bào đƣợc ly tâm trong 30 giây; phần dịch nổi đƣợc loại bỏ hồn tồn. 500 µl LB đƣợc bổ sung vào ống để hịa tan tồn bộ tế bào, sau đó tiếp tục đƣợc ly tâm 30 giây; phần dịch nổi đƣợc loại bỏ. Tiếp theo, 500µl LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp, tế bào đƣợc nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong 2 – 4 giờ, ở 28°C. Hỗn hợp tế bào biến nạp đƣợc cấy trải trên mơi trƣờng LB đặc có bổ sung Kanamycin 50 µg/ml, Streptomycin 50 µg/ml, Rifampicin 20 µg/ml và ủ ở 28°C trong 2 – 3 ngày. Sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen trong khuẩn lạc xuất hiện trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi đặc hiệu của từng cấu trúc.
2.2.7.2. Chuyển nạp gen vào thuốc lá thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens
Thí nghiệm chuyển nạp gen vào thuốc lá đƣợc thực hiện theo quy trình của Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật (Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế, Ấn Độ).
Để chuẩn bị nguyên liệu thực vật, hạt thuốc lá đƣợc khử trùng trong dung dịch NaOCl 2% trong 10 phút và rửa sạch lại bằng H2O cất khử trùng (5 lần). Hạt khử trùng đƣợc gieo trên môi trƣờng agar chứa muối MS 0,5 X và sucrose 1%, pH 5,8. Đĩa môi trƣờng đƣợc ủ ở 28o
C với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày, trong 10 – 14 ngày để hạt nảy mầm. Cây non 2 lá mầm sau đó đƣợc chuyển sang mơi trƣờng MS-T (Bảng 2.3) có pH 5,8 và tiếp tục giữ ở điều kiện 28oC với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày. Sau 1 tháng, cây con đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS-T mới chứa NAA 1 mg/l và giữ ở điều kiện 28oC với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày đến khi sử dụng (1 tháng chuyển môi trƣờng mới 1 lần).