CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.6.3. Phương pháp thu thập và phân tích số liệu
Tốc độ sinh trưởng: Định kỳ 5–10 ngày xác định khối lượng 30 cá thể bằng cân điện tử; đếm số cá còn lại ở các bể thí nghiệm. Tính tốc độ tăng trưởng trung bình về khối lượng theo công thức:
SGR (g/ngày) = (Wđầu - Wcuối)/(T2 – T1)
Trong đó: Wđầu, Wcuối là khối lượng cá (g) ban đầu và kết thúc thí nghiệm. T1, T2
là thời điểm ban đầu và kết thúc thí nghiệm (ngày).
Tỷ lệ sống: Tính tỉ lệ sống cho mỗi nghiệm thức: Là trung bình cho ba bể thí nghiệm theo công thức:
TLS (%) = 100% x Số cá thể kết thúc/tổng số cá thể ban đầu
Sử dụng phần mềm Excel để tính giá trị trung bình, sai tiêu chuẩn và so sánh mức độ sai khác giữa khối lượng cá (g) thu được ở các lô thí nghiệm.
2.3.7. Nghiên cứu một số bệnh trên cá tầm 2.3.7.1. Phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn
Sử dụng phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá và động vật thủy sản của Frerichs (1993), Bùi Quang Tề (1995), Đỗ Thị Hòa (2003), sơ đồ nghiên cứu như sau:
Thu mẫu
+ Thu mẫu chọn lọc, chỉ thu những con cá có dấu hiệu bệnh lý như sưng miệng, xuất huyết lở loét,… tại ao nuôi, lồng nuôi ở Klong Klanh và lồng nuôi cá tầm ở Tuyền Lâm -Lâm Đồng.
+ Cách thu và vận chuyển mẫu: Thu những con có dấu hiệu bệnh, vận chuyển bằng thùng xốp về Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III. Luôn duy trì nhiệt độ trong thùng ở mức 20 – 27oC
Phương pháp xử lý mẫu trong phòng thí nghiệm
+ Mẫu cá mang về được xử lý ngay. Quan sát, đo chiều dài cá bệnh và ghi chép các dấu hiệu trên cá: Màu sắc cá, các vết loét, các điểm xuất huyết, vây, miệng,…
+ Sử dụng kéo, dao, panh đã khử trùng bằng cồn 700 để giải phẫu. Khi nội tạng lộ ra, quan sát và ghi chép các hiện tượng khác thường như sự tích dịch, màu sắc dịch, biến đổi màu sắc hình dạng, thể trạng gan, thận, lách, mật, ruột,…
Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn
- Nuôi cấy từ mẫu bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm được lấy từ cá bệnh (vết loét, miệng, gan, thận), sau đó dùng để nuôi cấy vi khuẩn. Mẫu có thể được nuôi cấy tăng
sinh trong môi trường Peptone hoặc nuôi cấy trực tiếp trên môi trường chọn lọc hoặc không chọn lọc.
+ Các môi trường không chọn lọc bao gồm: Môi trường Nutrient Broth (NB); môi trường Triptic Soy Agar (TSA)
+ Các môi trường nuôi cấy chọn lọc: Môi trường Pseudomonas. Thu mẫu Pseudomonas spp.; Môi trường Thiosulphat Citrate Bile Sait Sucrose Agar (TCBS). Thu mẫu Vibrio spp.
- Nuôi cấy thuần chủng: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ cấy trên môi trường không chọn lọc như môi trường TSA.
- Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn theo phương pháp của Plumb & Bower (Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992).
- Thực hiện các phản ứng sinh hóa bằng Test Kit API – 20E (Analitical Profile Index) hoặc bằng dãy các phản ứng sinh hóa theo phương pháp truyền thống để xác định đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn.
Bảng 2.5: Dãy phản ứng sinh hóa API – 20E
1. Oxidase 2. Catalase 3. ONPG 4. ADH (Arginine) 5. LDC (Lysine) 6. ODC (ornithine) 7. CIT (Citrate) 8. H2S 9. URE (Urea) 10. TDA (Tryptophane) 11. IND (Indol) 12. VP (Voges-Proskauer) 13. GEL (Gelatine) 14. GLU (Glucose) 15. MAN (Malnitole) 16. INO (Inositole) 17. SOR (Sorbitole) 18. RHA (Rhaminose) 19. SAC (Sucrose) 20. MEL (Melibiose ) 21. AMY (Amygdalin) 22. ARA (Arabinose) 23. NO2 (khử nitrate)
- Kít thử API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ trong có chứa các chất nền đã khử nước. Trong quá trình ủ, hoạt động của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục môi trường. Sau 24h đọc các phản ứng đối chiếu theo bảng kết quả để định danh.
- Định danh vi khuẩn dựa vào những đặc điểm sinh lý và kết quả thử phản ứng sinh hoá, bảng tra kết quả API– 20E và hệ thống phân loại vi khuẩn của (Holt và ctv, 1994; Frerichs và ctv, 1993).
Phương pháp thu và vận chuyển mẫu
Đối với cá bố mẹ và cá giống
Phương pháp thu mẫu: Được tiến hành theo phương pháp thu mẫu chọn lọc như sau: Thu cá tầm bố mẹ và cá giống có dấu hiệu bệnh lý như da lở loét, nhợt nhạt, bơi lội không bình thường, bỏ ăn để nghiên cứu ký sinh trùng và vi khuẩn.
Phương pháp vận chuyển: Cho cá vào bao nilon có nước, bơm oxy, buộc chặt và cho vào thùng xốp, chèn đá chung quanh bao để đảm bảo nhiệt độ nước trong bao giao động trong khoảng 17- 220C, dán kín nắp. Vận chuyển về Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III.
Đối với trứng cá
Thu trứng từ bình veis cho vào chai nút mài, đậy kín. Xếp các chai nút mài vào thùng xốp, bỏ thêm đá vào thùng xốp để ổn định nhiệt độ trong khoảng 17- 220C, dán kín nắp thùng xốp. Vận chuyển về Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III.
2.3.7.2. Phương pháp nghiên cứu bệnh ký sinh trùng
Áp dụng phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng đồng bộ của Dogiel (1929) bổ sung bởi Bychowskaja & Pavlopkaia (1969), Hà Ký (1992) và Bùi Quang Tề (2002).
Các bước nghiên cứu ký sinh trùng cá tầm bố mẹ và cá giống
- Lấy mẫu máu: Đối với cá bố mẹ, Dùng xilanh lấy máu cá, hút trực tiếp từ tim, xilanh phải sạch và được sát trùng. Đối với cá giống thì cắt đuôi. Sau đó, nhỏ 1 giọt máu phết lên lam kính sạch, quan sát. Hoặc để lam khô trong không khí, cố định bằng cồn và ete tỷ lệ 1:1 trong 5 phút, để khô, quan sát.
- Quan sát bên ngoài cơ thể để phát hiện nhanh một số KST có kích thước lớn; - Cân khối lượng và đo chiều dài của cá;
- Quan sát ký sinh trùng ngoại ký sinh: Cạo nhớt da, vây, đuôi,… phết lên lam kính và quan sát dưới kính hiển vi;
- Quan sát ký sinh trùng nội ký sinh: Dùng kéo cắt dọc cơ thể theo đường cong bắt đầu từ hậu môn lên tới đường bên, xuống vây ngực, tách các bộ phận: tim, túi nước tiểu, dạ dày, ruột, gan, mật, lá lách và tuyến sinh dục, bóng hơi cho vào các hộp lồng chứa nước muối sinh lý. Dùng kéo nhỏ để xẻ ruột ra trước khi quan sát.
Nghiên cứu KST trên trứng cá:
Đưa trứng lên quan sát dưới kính soi nổi và kính hiển vi quang học, nếu phát hiện KST thì tách ra và làm tiêu bản tươi và tiêu bản cố định để nghiên cứu.
Định danh ký sinh trùng
- Tách KST ra từng nhóm loài riêng biệt và đếm số lượng từng nhóm loài. - Chụp hình, vẽ, đo đếm tổng quát và các bộ phận làm cơ sở phân loại của đại diện từng nhóm.
- Dựa vào các dấu hiệu phân loại đó để định danh thông qua các tài liệu phân loại như Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007), Muller & Anders (1986); Yamaguti (1971)... và một số tạp chí, bài báo về ký sinh trùng trong và ngoài nước.
Thử nghiệm trị bệnh ký sinh trùng
- Do số lượng cá bố mẹ ít, nên không bố trí thí nghiệm trị bệnh do ký sinh trùng gây ra mà chỉ thực hiện thí nghiệm với cá giống.
- Sau khi kiểm tra 30 con cá để đánh giá mức độ nhiễm KST, dựa vào thành phần và mức độ nhiễm KST trên cá, chia cá một cách ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô có 10 con. Sử dụng cá ương lồng để thí nghiệm. Giả sử tỷ lệ và cường độ nhiễm KST trên cá ở các lô thí nghiệm là ngang nhau.
- Bố trí thí nghiệm: Cá giống bị nhiễm bệnh KST, thử nghiệm trị bệnh bằng nước muối (20‰) và bằng nước oxy già sau đó so sánh với lô đối chứng.