2.3.4.1. Nguyên lý hoạt động của máy siêu âm
Cho đến nay không có máy siêu âm chuyên dùng cho nghề cá mà sử dụng thiết bị phục vụ cho y học. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy siêu âm xách tay của hãng SonoScape sản xuất tại Trung Quốc với bàn phím và màn hình được mở ra (Hình 2.5). Màn hình LCD đen trắng. Đầu dò convex hoạt động với tần số 3,5 – 5 MHz. Nguồn điện sử dụng là điện xoay chiều 100 – 220V. Công suất tiêu thụ 100 VA.
Hình 2.5: Máy siêu âm xách tay SSI-600 sử dụng để nghiên cứu cá tầm
Khi siêu âm người ta đặt đầu dò vào vị trí bên trên chỗ cần quan sát. Sóng siêu âm từ đầu dò phát ra theo dạng song song (đầu dò Linear) hoặc thành chùm (đầu dò Convex) tùy theo lựa chọn của người sử dụng. Sóng siêu âm sẽ lan truyền sâu vào trong cơ thể cá. Tần số càng cao cho hình ảnh càng rõ nét nhưng khả năng xuyên sâu càng giảm. Sau khi đi qua vật cản trở trên đường, một phần năng lượng của sóng siêu âm được phản xạ lại đầu dò. Cường độ và dạng sóng phản xạ phụ thuộc vào cấu trúc của vật thể mà sóng đi qua. Tín hiệu quay trở lại này được đưa về bộ xử lý trung tâm tạo nên hình ảnh số hóa đen trắng mà ta nhìn thấy được (Wildhaber et al., 2005).
Để có thể đọc được hình ảnh siêu âm về nội quan của cá tầm thì hình ảnh đó phải được nhận từ mặt bụng của cá (có thể là mặt bên nếu cá đủ lớn). Sự hiện diện của những vảy xương ở lưng và sườn của cá tầm sẽ cản trở sóng siêu âm đi qua bề mặt của những khu vực này. Sóng siêu âm không xuyên qua được bề mặt đã bị can-xi hóa của các vảy xương ở cá tầm. Vì thế không có ảnh siêu âm nào về nội quan cá nằm dưới những vảy xương này được hiện lên.
Siêu âm cá tầm có thể tiến hành ngay ở dưới nước. Muốn có được hình ảnh siêu âm nội quan một cách rõ ràng, ta phải lật ngửa cá lên, chìm dưới mặt nước 3–4 cm. Ở tư thế này cá tầm yên tĩnh hơn bình thường nên không cần phải dùng đến thuốc mê.
Với máy siêu âm loại này cho dù ở ngoài thực địa hay trong phòng thí nghiệm, thì kết quả siêu âm mỗi cá thể kể cả hình ảnh động và tĩnh đều được ghi lại vào bộ nhớ trung tâm. Sau đó có thể chuyển vào máy tính lưu giữ để sử dụng sau này (Wildhaber et al., 2005). Tính năng cụ thể của bàn phím, núm điều khiển và thao tác cụ thể sử dụng máy siêu âm xách tay Sona Scape SSI-600 theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.3.4.2. Chuẩn bị cá cho siêu âm
Để phân tách riêng cá đực và cá cái cá tầm bằng máy siêu âm thì buồng trứng và buồng sẹ đã có thể phân biệt được bằng mắt thường (Bảng 2.1). Trong điều kiện nuôi ở vùng nước ấm như ở Việt Nam thì cá phải đạt ít nhất là 1+– 2+ tuổi, thể trọng 1,5 – 3,0 kg/con trở lên (Chebanov et al., 2004).
Bảng 2.1: Kích thước cá tối thiểu có thể phân biệt đực và cái khi đang sống
Tên cá tầm và con lai
Trại nuôi cá nước ấm Trại giống nước tự nhiên Trọng lượng (kg) Tuổi (năm) Trọng lượng (kg) Tuổi (năm) A. ruthenus 0,3 – 0,6 1 – 1+ 0,3 – 0,6 2 – 2+ Huso huso 0,8 – 12,0 4 – 6 0,8 – 12,0 6 – 7 A. baerii 2,0 – 2,5 2 – 2+ 2,0 – 2,5 3 – 4 A. gueldenstaedtii 1,5 – 3,0 1+ – 2,0 1,5 – 3,0 2 – 3
Huso huso x A. ruthenus 1,0 – 2,0 1+ – 2,0 1,0 – 2,0 2+ – 3,0
A. gueldenstaedtii x A. baerii 0,8 – 2,0 1+ – 2,0 0,8 – 2,0 2 – 2+
Cá đưa vào siêu âm tuyến sinh dục yêu cầu trong ruột phải rỗng để hàm chất trong ruột không che mất hình ảnh tuyến sinh dục. Vì vậy, cần cho cá nhịn ăn ít nhất là 7 ngày trước khi đưa vào siêu âm.
Trước khi siêu âm xoang bụng cá người ta bôi một lớp gel lên bề mặt đầu chuyển đổi tần số (còn gọi là đầu dò), sau đó bọc đầu chuyển đổi tần số lại bằng một túi nylon. Trong quá trình siêu âm, tập trung chú ý đến chiều sâu, cường độ đầu ra và tần số ảnh phải ổn định. Các tham số khác của máy siêu âm tùy theo mục đích mà thay đổi cài đặt trong khoảng cho phép của máy.
Kết quả chẩn đoán bằng hình ảnh siêu âm được ghi vào nhật ký và đánh dấu cá theo phương pháp cắt vây thông thường. Một số cá đực và cái có tuyến sinh dục phát triển tốt, có triển vọng cho qua đông nhân tạo để thí nghiệm cho đẻ ngay đều được kiểm tra lại bằng phương pháp biopsy. Ngoài ra những cá thể cho hình ảnh không rõ hoặc khó phân biệt đực cái cũng được kiểm tra bằng biopsy.
2.3.4.3. Quy trình siêu âm
Bố trí nơi làm việc:
+ Bàn đặt máy và thiết bị phải đủ chỗ cho người thao tác có thể tiến hành điều khiển màn hình. Bàn đặt cá có thành chắn để cá không nhảy ra ngoài
+ Ổ cắm điện xoay chiều gần sát bàn làm việc. Nơi làm việc có độ chiếu sáng vừa phải để không ảnh hưởng tới việc đọc các dữ liệu trên màn hình
+ Bố trí để người làm việc có thể di chuyển đầu cảm biến, điều khiển và đọc màn hình. Có không gian rộng để 1-2 người có thể đứng ngay bên bàn làm việc để giữ cá hoặc làm việc cần thiết theo yêu cầu của người sử dụng, bàn để cá phải cố định vững chãi.
Cài đặt máy siêu âm: Chọn kiểu B trước khi sử dụng máy siêu âm. Điều chỉnh
mức độ chiều sâu như sau: Độ sáng màn hình điều chỉnh sao cho dễ nhìn. Khi ở ngoài trời nên đặt ở mức cao. Chiều sâu cần dò tùy thuộc vào kích cỡ cá. Nếu trọng lượng dưới 1kg thì đặt 3cm, cá 1-2 kg đặt 4-5 cm, cá lớn hơn đặt 5-6 cm. Trước khi siêu âm cần phải dán đầu cảm biến của dây truyền dữ liệu bằng băng keo 2 lớp.
Tư thế của cá trên bàn kiểm tra: Cá được đặt trên bàn kiểm tra sao cho thuận lợi để thao tác. Giữ cá yên tĩnh trong quá trình kiểm tra. Cá cỡ nhỏ có thể 1 người giữ. Cá > 3-4 kg nên có 2 người trở lên giữ. Không kiểm tra cá khi thời tiết không thuận lợi: trời mưa, gió hay quá nóng.
Hình 2.6: Bố trí bàn kiểm tra siêu âm cá tầm
Các bước thao tác siêu âm:
Tìm vị trí chính diện tại vị trí giữa hang vảy thứ 3-4 tính từ vây hậu môn, tốt nhất bằng cách nghiêng đầu cảm biến sang bên phải hoặc bên trái. Sau đó nếu thấy cần thiết thì di chuyển chậm rãi đầu cảm biến về phía đầu trên mặt phẳng đã chọn đến phần giữa cơ thể cá (Hình 2.7).
Hình 2.7: Vị trí đầu cảm biến và hình ảnh siêu âm cá tầm
Trường hợp khó tìm thấy tuyến sinh dục hoặc muốn tìm vị trí chính xác của tổ chức sinh tế bào sinh dục trên tuyến sinh dục người ta sử dụng kiểu scan cắt ngang. Khu vực cắt ngang cũng nằm ở vị trí vảy thứ 3-4. Kiểm tra lúc này tiến hành dọc theo tuyến sinh dục bằng cách di chuyển đầu cảm biến về phía đầu cá. Nhưng cách này thường cho ít thông tin.
Cách hiệu quả là di chuyển đầu cảm biến theo chiều kim đồng hồ sau khi đã tìm thấy vị trí của tuyến sinh dục ở khu vực cắt ngang. Điều quan trọng hơn cả là giữ hình ảnh tuyến sinh dục cho đến khi nhận được chất lượng hình ảnh mặt trước tốt nhất. Sau đó tiến hành kiểm tra bình thường.
2.3.5. Nghiên cứu kỹ thuật kích thích sinh sản nhân tạo
Các bước thực hiện: Cá bố mẹ được nuôi qua đông nhân tạo, sau đó kiểm tra khi trứng đạt đến giai đoạn IV thì tiến hành tiêm kích dục tố. Sau đó, thu sản phẩm sinh dục là trứng và tinh trùng đem thụ tinh, khử dính và ấp nở.
2.3.5.1. Tuyển chọn cá bố mẹ, tiến hành qua đông nhân tạo
Nguồn cá bố mẹ:
Cá tầm Nga trên 4 năm tuổi (4+), đàn cá này được ấp nở tại Việt Nam ngày 01/04/2007. Trong đàn chỉ chọn được 1 cá đực trọng lượng 5,5 kg/con và 1 cá cái trọng lượng 7,8 kg/con. Cá cái đưa vào qua đông có trứng giai đoạn 4, có độ cực hóa nhân PI = 0.38. Cá tầm Xi-bê-ri, trên 4 năm tuổi (4+), đàn cá chọn được 4 cá cái và 4 cá đực có trọng lượng cá thể theo Bảng 2.2:
Bảng 2.2: Trọng lượng cá tầm Xi-bê-ri được tuyển chọn để qua đông
Cá đực Cá cái Số thứ tự Trọng lượng (kg) Số thứ tự Trọng lượng (kg) 1 7,5 1 10,5 2 8,5 2 7,8 3 5,5 3 8,5 4 5,8 4 6,0
Tiêu chuẩn tuyển chọn cá cho thí nghiệm qua đông là độ chín mùi tuyến sinh dục. Cá đực phải có buồng sẹ ở giai đoạn III hoặc II – III. Cá cái có buồng trứng ở giai đoạn IV. Cá bố mẹ được chọn sơ bộ bằng phương pháp siêu âm. Sau đó số cá tốt được kiểm nghiệm lại bằng phương pháp biopsy.
Sau khi quan sát bằng mắt thường mẫu trứng cá lấy được bằng biopsy, số cá cái có trứng tốt nhất trước khi đưa vào thí nghiệm qua đông đều được xác định độ cực hóa của trứng theo phương pháp Kazanski và cộng sự (1978). Cách làm như sau: Dùng que thăm trứng chọc vào bụng cá ở vị trí tấm vảy bụng thứ 3 – 4, lấy trứng ra và ngâm trong dung dịch Xera (một hỗn hợp gồm Formol, axit axetic và cồn) trong vòng 2 giờ. Sau đó lấy 10 trứng dùng dao sắc cắt dọc trứng theo chiều từ cực động vật đến cực thực vật. Đặt vào kính giải phẫu quan sát. Đo cự li từ nhân trứng đến viền trong của vỏ trứng. Tính độ cực hóa của nhân trứng theo công thức (Hình 2.4): L = (A/B) x 100% (với L – hệ số cực hóa của trứng; A – khoảng cách từ mép nhân trứng đến viền trong vỏ trứng; B – Chiều dài trứng từ cực động vật đến cực thực vật).
Cũng theo Kazanski (1978) thì độ cực hóa (PI) đối với cá tầm tốt nhất ở trong khoảng 1/30 – 1/40 tức là PI = 0,03 – 0,025. Tuy nhiên theo Chapman et al. (2007) thì chỉ số PI đối với cá tầm chỉ cần <0,1 tức là nằm trong khoảng 0,07 – 0,08 là có thể tiêm cho đẻ được.
Thiết bị hạ nhiệt cho cá qua đông:
Việc qua đông nhân tạo được tiến hành trong hệ thống nuôi tuần hoàn khép kín kết nối với máy làm lạnh nước và sục khí. Do bể chứa dung tích nhỏ, công suất máy làm lạnh không lớn nên để dễ điều khiển đã thiết kế hai hệ thống kết cấu tương tự như nhau dùng phân biệt cho cá đực và cá cái qua đông. Hình 2.2 và mục 2.3.3.2 trình bày kết cấu và nguyên lý hoạt động của hệ thống qua đông nhân tạo dành cho cá tầm.
Chất lượng nước được cải thiện trong quá trình qua đông nhân tạo nhờ việc thay và bổ sung 15–20% nước mới hàng ngày. Hệ thống nuôi nước tuần hoàn dùng cho cá đực có kết cấu hoàn toàn giống với hệ thống dành cho cá cái (Hình 2.2 và mục 2.3.3.2).
2.3.5.2. Qui trình cho cá qua đông nhân tạo
Cá bố mẹ được tuyển chọn sau khi thả vào bể qua đông giữ ở nhiệt độ nuôi bình thường (15-18oC) độ 3–5 ngày cho cá quen với điều kiện chật hẹp của bể, đồng thời cũng để cá thải hết phân.
Tiếp theo, hạ nhiệt độ nước 1oC/ngày đến khi đạt được 6oC thì giữ ổn định ở nhiệt độ này để qua đông. Thời gian giữ cá ở nhiệt độ 6oC là 14–15 ngày. Sau đó nâng nhiệt độ nước ở chế độ qua đông lên nhiệt độ đẻ trứng. Mỗi ngày nâng 1,0–1,50C cho đến khi nhiệt độ đạt 15ºС thì dừng lại.
Tiến trình điều khiển nhiệt độ trong thời gian trú đông nhân tạo được trình bày theo sơ đồ hình 6. Thời gian gian cách từng giai đoạn cụ thể, tốc độ hạ hoặc nâng nhiệt có thể thay đổi theo loài, tình trạng phát dục và sinh lý của cá. Trong khi qua đông hoàn toàn không cho cá ăn.
Hình 2.8: Biến động nhiệt độ cho cá tầm qua đông nhân tạo
Sau khi qua đông, tiến hành kiểm tra độ cực hóa của trứng. Những cá thể có phần lớn trứng có độ cực hóa PI = 0.06-0.08 sẽ được chuyển sang tiêm kích thích tố cho sinh sản nhân tạo.
2.3.5.3. Kỹ thuật kích thích sinh sản
Hormon thường dùng trong sinh sản nhân tạo cá tầm trước đây là hypophis của cá tầm hoặc cá chép. Tỷ lệ cá cái rụng trứng sau khi tiêm dao động trong khoảng 39– 86%. Hiện nay rất ít sử dụng hypophis vì đắt và khó tìm. Đã tìm được một số chất kích thích thay thế, kết quả cũng khá ổn định. Trong đó, loại kích thích tố dùng phổ biến hơn cả là GnRH (Gonadotropin-releasing hormone) trước đây thường gọi là Luteinising-hormone releasing hormone (LH-RH). Đây là một loại hormone kích thích giải phóng FSH và LH có nguồn gốc từ hypothalamus. Hiệu quả kích thích rụng trứng của GnRH mạnh gấp hàng nghìn lần hypophis. Hormone GnRH đã có thể tổng hợp được ở dạng tương tự có giá rẻ hơn hypophis có tên là GnRH-a.
Ovopel được chế tạo từ GnRH-a và chất kháng dopamin, là dạng viên dễ tan trong nước. Hoạt tính mỗi viên ovopel tương đương với 3 mg hypophis cá chép khô (Das, 2004). Liều lượng và cách tiêm cho cá tầm được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Kích thích tố dùng trong sinh sản nhân tạo cá tầm Nga
Cá cái Cá đực
Loại kích thích tố *CCP Surfagon *GnRH CCP Ovopel GnRH
Liều lượng (mg/kg) 5 – 7 2 0,1 1 1 viên 0,01
Thời gian hiệu ứng (giờ) 24 – 40 26 – 38 18 – 22 Ghi chú *Tiêm 2 lần, lần đầu tiêm 10%
liều lượng
Tiêm 1 lần
Trong quá trình thí nghiệm đã sử dụng các loại kích thích tố sau: hypophis của cá chép (CCP – Common Carp Pituitary), LRH-a do Trung quốc sản xuất và Surfagone do Nga sản xuất để tiêm cho cá đực và cá cái. Liều lượng sử dụng như sau: Sử dụng phương pháp tiêm 2 lần đối với cá cái và 1 lần đối với cá đực. Cá cái: Lần đầu tiêm 10 % tổng liều, 12 giờ sau tiêm lần 2 tiêm phần còn lại; Cá đực: Tiêm 2–3 giờ trước khi tiêm lần 2 cho các cái.
Loại kích thích tố Cá cái Cá đực CCP (Common Carp Pituitary) 6 mg/kg 3mg/kg
GnRH-a (surfagone) 2 mg/kg 1 mg/kg
LH-RH-a Trung quốc 0,1 mg/kg + DOM 0,05 mg/kg + ½ DOM
2.3.5.4. Thu trứng và sẹ, thụ tinh, khử dính, ấp trứng
Kết quả cụ thể của quá trình tuyển chọn, cho cá qua đông và tiêm kích thích tố được thể hiện thông qua việc đánh giá chất lượng trứng và sẹ thu được.
Thu trứng và sẹ:
Sau khi tiêm liều quyết định 8-10 giờ thì kiểm tra phản ứng của cá đực và cá cái 1 giờ một lần để kịp thời thu trứng và sẹ. Thu sản phẩm sinh sản được tiến hành trong nhà có mái che. Thu sẹ tiến hành khoảng 1 giờ trước khi thu trứng và bảo quản trong tủ lạnh 12oC. Dùng bơm tiêm 100 ml, nối với ống dẫn bằng nhựa dẻo luồn qua lỗ sinh dục và hút tinh (Hình 2.9). Tinh dịch cá đực được để riêng từng cá thể.
Hình 2.9: Thu sẹ và trứng cá tầm
Khi thu trứng lau cá bằng khăn khô, dụng cụ hứng trứng có đáy nhẵn và khô tuyệt đối. Thu trứng cá tầm theo cách giữ sống cá mẹ của Pa-dush-ka (1986). Phương pháp này thực hiện bằng cách dùng một dao giải phẫu nhỏ rạch một đường của một nhánh ống dẫn trứng để cho trứng thoát ra (Hình 2.9).
Hình 2.10: Mổ bụng thu trứng cá và khâu vết mổ
Do đặc tính rụng trứng của cá tầm Nga và cá tâm Xi-bê-ri đều rụng phân đợt nên việc thu trứng phải tiến hành làm nhiều lần, mỗi lần cách nhau khoảng 2 giờ. Sau khi thu trứng lập tức cho thụ tinh nhân tạo. Một số cá cái rụng trứng không hoàn toàn, không thể thu trứng theo phương pháp Pa-đush-ka mà phải sử dụng phương pháp mổ bụng cá để thu trứng, sau đó khâu lại vết thương bằng chỉ tự tiêu (Hình 2.10).