C 18H26O 2+ 26O2 → 18O 2+ 18H2O
3. Sự sinh trưởng và phân hoá tế bào Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sự sinh trưởng của tế bào được chia thành hai giai đoạn: giai đoạn phân chia tế bào (giai đoạn phôi sinh) và giai đoạn dãn của tế bào.
3.1.Giai đoạn phân chia tế bào
Sự phân chia tế bào xảy ra trong mô phân sinh. Có ba loại mô phân sinh trong cây là mô phân sinh đỉnh nằm tận cùng của thân, cành, rễ, mô phân sinh lóng ở giữa các đốt cây hòa thảo và mô phân sinh tượng tầng nằm ở giữa gỗ và libe.
Đặc trưng chung của giai đoạn phân chia tế bào
Các tế bào trong giai đoạn phôi sinh có kích thước bé, đồng nhất, thành tế bào mỏng, chưa có không bào, nhân to. Số lượng tế bào tăng lên nhanh chóng nhưng kích thước tế bào mẹ thì bắt đầu phân chia đôi.
Điều kiện cần thiết
Sự có mặt xytokinin là điều kiện tiên quyết vì nó là hocmon hoạt hóa sự phân chia tế bào. Thuộc về điều kiện ngoại cảnh, trước hết là nước và nhiệt độ. Mô phân sinh bão hòa nước là điều kiện tối ưu cho sự phân chia tế bào. Nhiệt độ tối ưu khoảng 20- 25oC. Nếu gặp hạn và rét thì sự phân chia tế bào bị ức chế.
3.2. Giai đoạn dãn của tế bào
Sau giai đoạn phân chia, tế bào bước vào giai đoạn dãn để tăng nhanh về kích thước. Sự sinh trưởng của cơ quan và toàn cây phụ thuộc vào sự dãn của tế bào.
Đặc trưng chung của giai đoạn tế bào dãn
Tế bào bắt đầu xuất hiện không bào, ban đầu là nhiều túi nhỏ, sau đó liên kết với nhau thành các túi to và cuối cùng thành một không bào trung tâm chiếm hầu hết thể
tích của tế bào, dồn ép chất nguyên sinh và nhân ra sát thành tế bào. Không bào chứa các chất bài tiết hữu cơ và vô cơ khác nhau như axit hữu cơ, các sắc tố dịch bào, các muối vô cơ…tạo nên áp suất thẩm thấu, nhờ đó mà tế bào hút nước gây nên sức trương để có lực dãn tế bào. Chính vì vậy mà kích thước tế bào tăng lên rất nhanh. Có trường hợp trong vòng vài giờ, kích thước tế bào tăng lên hơn chục lần so với tế bào phôi sinh.
Điều kiện cần cho sự dãn tế bào
Trước hết phải có các chất hocmon kích thích sự dãn tế bào là auxin và Gb. Auxin kích thích tế bào dãn theo chiều ngang, còn Gb kích thích theo chiều dọc. Nếu thiếu cả hai hocmon này, tế bào không thể dãn được; còn thiếu một trong hai chất thì sự dãn của tế bào mất cân đối. Ví dụ như thiếu GA khiến cây bị lùn, còn thiếu IAA thì cây vươn cao nhiều.
Điều kiện ngoại cảnh quan trọng nhất là nước. Sự hấp thu nước thẩm thấu vào tế bào làm tăng sức trương (P) gây một sức đẩy lên thành tế bào giống như bơm không khí vào bóng cao su có ý nghĩa quyết định cho sự dãn của tế bào.
Chính vì vậy, trong thực tế, nếu muốn kìm hãm sự sinh trưởng không cần thiết của cây (chẳng hạn trong trường hợp có nguy cơ lốp đổ) thì tạo điều kiện khô hạn trong thời gian mà các tế bào tập trung dãn.
Ví dụ, lúc lúa đứng cái là lúc lúa vươn lóng mạnh, các tế bào dãn nhanh, nên việc rút nước phơi ruộng trong giai đoạn này sẽ hạn chế được lúa bị lốp đổ.
Để ức chế pha dãn của tế bào, có thể sử dụng các chất trong nhóm retardant như CCC là chất kháng GA trong cây. CCC sẽ kìm hãm sự dãn của tế bào làm cây lùn, cứng cây và có thể chống đổ. Các yếu tố dinh dưỡng khoáng, đặc biệt là nitơ có ý nghĩa quan trọng trong việc tăng nhanh kích thước của tế bào…
3.3. Sự phân hóa, phản phân hóa và tính toàn năng của tế bào
3.3.1. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hóa tế bào
Sự phân chia và dãn của tế bào là hai giai đoạn của sự sinh trưởng tế bào. Trong hai giai đoạn này, tế bào chưa có những đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng. Các tế bào gần như giống như nhau. Sau đó, các tế bào bắt đầu phân hóa thành các mô chuyên hóa đảm nhiệm các chức năng khác nhau. Các tế bào trong giai đoạn này đã có các đặc trưng khác nhau về cấu trúc và chức năng. Ví dụ: tế bào mô bì có ngấm cutin hay bần, sáp…làm nhiệm vụ che chở, mô dậu có chứa lục lạp và diệp lục làm nhiệm vụ che chở, mô dậu có chứa lục lạp và diệp lục làm nhiệm vụ quang hợp; một số tế bào mất chất nguyên sinh và hóa gỗ để làm nhiệm vụ dẫn truyền nước và chống đỡ… Trong cây có khoảng 15 loại mô chuyên hóa khác nhau nhưng chúng đều có nguồn gốc từ một tế bào hợp tử đầu tiên phân hóa thành. Có thể nói rằng sự phân hóa tế bào là sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa.
Sự phản phân hóa tế bào
Sự phản phân hóa tế bào là quá trình diễn ra ngược với sự phân hóa tế bào. Các tế bào đã phân hóa trong các mô chức năng không mấ đi khả năng phân chia của mình mà trong các điều kiện nhất định chúng có thể quay trở lại đóng vai trò như mô phân sinh và có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới. Chẳng hạn như ta có thể lấy một mẫu mô nào đó của cây (đã phân hóa) cho vào nuôi cấy trong môi trường thích hợp, chúng lại phân chia để cho ra các tế bào mới hình thành mô sẹo rồi từ đấy phân
hóa thành các cơ quan như rễ và chồi. Lúc giâm cành, chiết cành, từ các mô đã chuyên hóa khi được kích thích bằng cắt rời khỏi cơ thể mẹ, bằng khoanh vỏ, bằng xử lý hóa chất hay bó bầu…thì các tế bào đó quay trở lại phân chia mạnh mẽ để cho ea các tế bào mới là cơ sở của rễ mới.
3.3.2. Tính toàn năng của tế bào
Cơ sở của sự phân hóa và phản phân hóa tế bào là tính toàn năng của tế bào. Mỗi một tế bào đã chuyên hóa chứa một lượng thông tin di truyền (bộ AND) tương đương với một cơ thể trưởng thành để trong điều kiện nhất định tế bào đó có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào.
Như vậy bất cứ một tế bào nào cũng có thể thành một cây hoàn chỉnh và đó cũng là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy in vitro, kỹ thuật nhân bản ở thực vật. Về mặt di truyền phân tử có thể nói rằng toàn bộ quá trình phát triển cá thể của cây từ hợp tử cho đến khi cây chết ở tuổi tối đa đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử AND đặc trưng cho loài. Đời sống của cây là quá trình thực hiện dần dần chương trình di truyền đó mà thôi. Dưới sự thay đổi và tác động của điều kiện nội tại và ngoại cảnh mà các chương trình di truyền đó dần được biểu hiện bằng sự phát sinh hình thái.
3.4. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực của công nghệ sinh học thực vật. Dựa trên tính toàn năng của tế bào và khả năng phân hóa và phản phân hóa của chúng mà người ta có thể tái sinh cây từ một tế bào hay một mẫu mô nào đấy.
Điều kiện cần thiết của nuối cấy in vitro
Điều kiện trước tiên là vô trùng. Tất cả các khâu nuôi cấy đều được thanh trùng: dụng cụ nuôi cấy, mẫu nuôi cấy, môi trường (giá thể) và các thao tác nuôi cấy…Sự thành công hay thất bại của công việc nuôi cấy mô là phụ thuộc vào việc vô trùng. Nếu có một khâu nào đó không vô trùng thì mẫu nuôi cấy lập tức bị nhiễm trùng và sẽ chết.
Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô là phòng thí nghiệm chuyên jóa cao với các thiết bị chuyên dụng, bao gồm một phòng chuẩn bị mẫu, phòng cấy mẫu, phòng nuôi cây và nhà lưới để đưa cây ra đất. Tùy theo quy mô và mục đích mà diện tích các bộ phân khác nhau. Các thếit bị quan trọng nhất của phòng nuôi cấy mô gồm có nồi hấp vô trùng dụng cụ và mẫu nuôi cấy, máy cấy vô trùng để thao tác cấy mẫu, phòng nuôi có đủ ánh sáng nhân tạo và điều hòa nhiệt độ …để nuôi cây…
Môi trường nuôi cấy là giá thể có đầy đủ chất dinh dưỡng, các hoạt chất như vi lượng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng. Tùy theo từng loại cây và cơ quan nuôi cấy mà người ta đã có các môi trường riêng cho chúng. Ví dụ: Môi trường cơ bản nhất là môi trường MS (Murashige Skoog) cho nhiều đối tượng cây trồng, môi trường Anderson cho cây thân gỗ nhỏ, môi trường Gamborg cho nuôi cấy tế bào trần, môi trường CHU cho nuôi cấy bao phấn…
Các bước tiến hành
Quá trình nuôi cấy mô gồm các bước sau:
- Tạo vật liệu khởi đầu cho việc nuôi cấy. Tùy theo từng loại cây mà chọn các bộ phận nuôi cấy thích hợp. Trong nhiều trường hợp, bộ phận nuôi cấy thích hợp nhất là chồi. Bước tiếp theo là khử trùng mẫu, thường bằng hóa chất khử trùng. Sau đó người ta đưa mẫu đã khử trùng vào môi trường khởi động để tái sinh cây.
- Bước thứ hai là nhân nhanh. Chuyển mẫu vào môi trường nhân nhanh có hàm lượng xytokinin cao hơn để tái sinh thật nhiều chồi. Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong ống nghiệm.
- Bước thứ ba là tạo cây hoàn chỉnh. Người ta tách các chồi riêng ra và cho vào môi trường tạo rễ có hàm lượng auxin cao hơn. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh.
Cuối cùng, khi cây trong ống nghiệm đủ tiêu chuẩn, người ta đưa ra đất trồng. Trước khi đưa ra trồng ngoài đất, người ta thường chuyển ra khay đất đặt trong nhà lưới có điều chỉnh ánh sáng, độ ẩm thích hợp cho cây thích nghi dần với môi trường ngoài ống nghiệm thì tỷ lệ sống cao hơn…
Trên đây là tóm tắt toàn bộ quy trình vi nhân giống in vitro chung của các cây trồng. Tùy theo từng loại cây mà có các quy trình nhân giống riêng mang tính đặc thù cho giống. Muốn có quy trình nhân giống riêng thì phải tiến hành các nghiên cứu riêng cho từng giống.
Ứng dụng nuôi cấy in vitro
Nhân giống vô tính: Đây là một lĩnh vực ứng dụng của nuôi cấy mô hiệu quả nhất hiện nay. Ưu việt của phương pháp này là trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây giống lớn đồng đều về hình thái và di truyền để phủ kín diện một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra nó không phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết, có thể tiến hành quanh năm. Phương pháp này càng ưu việt trong trường hợp muốn nhân nhanh các giống trồng quý hiếm hoặc không thể nhân bằng các phương pháp khác…
Làm sạch bệnh để phục tráng giống: các cây trồng đặc biệt là các cây nhân giống vô tính thường bị thoái hóa rất nahnh do nhiễm bệnh, đặc biệt là virus. Người ta có thể nuôi cấy mô phân sinh là mô không mang mầm bệnh để tạo cây sạch bệnh và giống đã được phục tráng.
Tạo giống: Có thể nuôi cấy hạt phấn để tạo cây đơn bội (1n). Từ các cá thể đơn bội, ta có thể nhị bội để tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối chỉ sau 1 thế hệ mà bằng con đường tự phối thì phải mất 5-7 thế hệ. Người ta có thể nuôi cấy tế bào trần (tế bào đã loại bỏ thành tế bào) và dung hợp các tế bào trần tức là trộn lẫn chất nguyên sinh của hai tế bào để tạo ra hợp tử bằng lai vô tính giữa hai tế bào trần (lai soma) và tái sinh cây thu được cây lai có đặc tính của bố và mẹ…
Ngoài ra có thể sử dụng nuôi cấy mô tế bào để nghiên cứu di truyền, biến dị, nghiên cứu sinh lý, hóa sinh…