1.3.4.1 Giới thiệu về phổ khối lượng trong vịêc phân tắch peptide và protein
Trước ựây, việc xác ựịnh trình tự amino acid của một phân tử protein rất phức tạp, ựầu tiên sử dụng các enzyme cắt ựặc hiệu, dùng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp cho việc tách
peptide, sau ựó xác ựịnh trình tự ựầu N bằng phương pháp Edman. Phân tắch theo phương pháp này rất tốn thời gian, hàm lượng protein cần cho phân tắch khoảng 100pmol [93], ựoạn peptide lớn hơn 50 amino acid sẽ cho ựộ chắnh xác không cao. Hiện nay, dựa trên sự cải tiến quá trình ion hóa, việc phân tắch protein bằng phổ khối lượng ựã trở thành một công cụ ựắc lực cho các ngành sinh học, sinh y học Ầ Vì nó ựáp ứng ựược các yêu cầu cơ bản trong phân tắch sâu về protein không những ở việc xác ựịnh trình tự amino acid, mà có thể ựối phó với các protein ở dạng phức hợp với hàm lượng rất nhỏ. đặc biệt có khả năng xác ựịnh các biến ựổi sau quá trình giải mã nhờ dãi phát hiện ựộng học rộng, việc phân tắch protein có thể cho kết quả ựáng tin cậy [91].
Cơ sở của phương pháp phổ khối lượng là sự bắn phá phân tử bởi các nguồn ion hóa, chuyển các phân tử không tắch ựiện thành các phần tử mang ựiện tắch dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc tự do bởi các phần tử mang năng lượng cao. Peptide và protein là những phân tử không ổn ựịnh bởi nhiệt. Vì vậy nó cần ựược thực hiện ion hóa bằng phương pháp ỘmềmỢ ựể tạo ra các ion còn giữ nguyên tắnh chất. Có hai phương pháp thắch hợp cho phân tắch peptide và protein là ion hóa hấp phụ bức xạ laser (Matrix- Assisted Laser Desorption Ionisation: MALDI) và ion hóa phun ựiện (Electrospray Ionisation : ESI). Các phần tử tắch ựiện và các gốc tự do sau khi ựược tạo thành sẽ ựược tách ra khỏi nhau theo số khối m/z nhờ bộ phận phân tắch TOF (thời gian bay) hoặc các bộ phận phân tắch bẫy khối tứ cực dùng trong thiết bị khối phổ hai lần MS-MS, vì thế sẽ xác ựịnh thật chắnh xác khối lượng phân tử của chúng [91].
1.3.4.2 Các bước phân tắch protein theo phương pháp phổ khối lượng
Thu nhận các ựiểm protein trên ựiện di ựồ sau khi chạy ựiện di một chiều hoặc hai chiều. Tiến hành phân cắt chúng bằng các enzyme ựặc hiệu thành hỗn hợp các peptide, sau ựó sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF hoặc ESI-MS-MS ựể lập bản ựồ khối lượng peptide kết hợp nghiên cứu dữ liệu trình tự protein không giới hạn NRDB (Non-redundant protein sequence database) trên website [118].
Quy trình trên ựược tóm lược theo sơ ựồ hình 1.8:
Hình 1.8: Quy trình lập bản ựồ phân tắch protein theo phương pháp phổ khối lượng
Mẫu phân tắch Tách protein 1-DE or 2-DE Thủy phân protein Phân tắch MS. Lập bản ựồ peptid
Nghiên cứu dữ liệu. Xác ựịnh protein
đây là kỹ thuật hiện ựại có ựộ chắnh xác khá cao và tiện lợi về mặt tốc ựộ phân tắch ựể xác ựịnh trình tự amino acid trong phân tử protein nên thường ựược áp dụng trong các phòng thắ nghiệm hiện nay. Nếu ựạt kết quả có thể sử dụng ựể giải trình tự nucleotide và nhân dòng với gen tương thắch.
Chọn enzyme cắt: Chọn enzyme cắt tạo ra các peptide có khối lương tương thắch với phân tắch phổ khối lượng MS và nghiên cứu dữ liệu ựể có ựộ chắnh xác ựắch thực. Một vài tắnh chất chuyên biệt của enzyme ựược trình bày ở bảng 1.4:
Bảng 1.5: Tắnh chất enzyme cắt chuyên biệt phân giải protein trong phân tắch MS
Protease Vị trắ cắt chuyên biệt Phân tắch MS Nghiên cứu dữ liệu Trypsin Cắt chọn lọc rất cao ở ựầu
C của Arg &Lys
Tuyệt hảo, peptide tạo ựược có kắch thước 500-2500Da. Có hạn chế tự phân hủy.
Tốt, chỉ có 2 amino acid phải xem xét cho ựầu cuối C
Lys-C* Cắt ựộc quyền ở ựầu cuối C của Lys có tắnh chuyên biệt cao
Tốt. Peptide tạo ra khá lớn thắch hợp cho nghiên cứu phosphopeptide. Không tự hủy. Làm việc với MS-MS bị ảnh hưởng các mạch nhánh Arg nội phân tử.
Tốt, chỉ có 1 amino acid phải xem xét cho ựầu cuối C
Glu-C** Phụ thuộc pH, cắt ở ựầu C của Glu (pH4); Glu & Asp (pH7), khả năng cắt chuyên biệt trung bình
Trung bình, tái tạo lại các peptide tự phân cắt. Làm việc với MS-MS bị ảnh hưởng các mạch nhánh Arg, Lys nội phân tử
Tốt, chỉ có 2 amino acid phải xem xét cho ựầu cuối C
*Lys-C là enzyme thuộc nhóm serine protease có khối lượng phân tử 33kDa
**Glu-C hay còn gọi là V8-protease thuộc nhóm serine protease có khối lượng phân tử 30kDa
Yêu cầu quan trọng nhất là phải cắt ựặc hiệu tại các vị trắ cắt chuyên biệt. Ngoài ra cần chú ý ựến kắch thước trung bình của peptide tạo thành. Trypsin cho số lượng lớn các peptide nhỏ, trong khi Lys-C lại cho số lượng peptide ắt nhưng phân tử có kắch thước khá lớn. Một trình tự amino acid ựược xác ựịnh dễ dàng nếu phân tắch từ các peptide có kắch thước nhỏ hơn là peptide có kắch thước lớn. Vì thế gần như tất cả các yêu cầu cho phân tắch phổ khối lượng và nghiên cứu dữ liệu thì trypsin là protease ựược sử dụng phổ biến nhất cho các ứng dụng trong thực tế. Các peptide tạo thành từ sự phân giải protein bởi trypsin có khối lượng phân tử khoảng 500-2500Da ựáp ứng ựược yêu cầu phân tắch của phương pháp phổ khối lượng. Hơn nữa các amino acid base chắc chắn nằm ở ựầu cuối của chuỗi peptide, vì vậy dễ dàng dự ựoán bởi sắc phổ ựồ MS-MS [93].
Xác ựịnh protein dựa trên bản ựồ khối lượng peptide
Protein sau khi bị phân giải bởi enzyme cắt chuyên biệt thu hỗn hợp các peptide và ựược tách ra bằng phổ khối lượng MALDI-TOF-TOF hoặc ESI-MS-MS ựể xác ựịnh khối lượng phân tử chắnh xác các peptide này. Sau ựó so sánh với tất cả các dữ liệu về trình tự amino acid của các peptide hoặc dịch mã thành trình tự nucleotide trên các website. để lập bản ựồ peptide của một protein một cách chắnh xác và có ý nghĩa thống kê thì khối lượng peptide xác ựịnh thực tế và tắnh toán phải ựược xem xét qua hai thông số sau: - đoạn peptide có khối lượng ựã xác ựịnh trong thực nghiệm ựược so sánh tương ựồng (match) với peptide có khối lượng biết trước từ những protein có trong dữ liệu, nếu càng gần loài hoặc nhóm với nhau thì ựộ tin cậy càng cao.
- Số lượng các peptide sử dụng ựể so sánh với các dữ liệu trên một phần mềm nào ựó càng lớn thì tắnh chuyên biệt càng cao.
Khối lượng chắnh xác của các peptide phân tắch là vấn ựề quan trọng. Hiện nay, công cụ thực hiện thường là MALDI kết hợp với phổ kế thời gian bay phản xạ (R-TOF) là lý tưởng nhất ựể nghiên cứu các dữ liệu với sự chắnh xác trong dãy 30-50ppm.
Các kỹ thuật nghiên cứu khối lượng peptide chắnh xác cũng ựược ựưa vào trong tiến trình thắ nghiệm như thiết lập ựường cong nội chuẩn, bằng cách trộn vào mẫu phân tắch trypsin ựã biết trình tự amino acid, enzyme này có khả năng tự thủy phân chắnh nó tạo ra các peptide có khối lượng chắnh xác. Mặc khác sự cải biến các mạch nhánh của amino acid ựặc biệt như cysteine, methionine, hoặc metyl hóa các nhóm carboxyl của ựoạn peptide nhằm có thể suy ựoán trình tự các amino acid trong ựoạn peptide. Dưới ựây là một vài tiêu chuẩn khi xác ựịnh protein bằng bản ựồ khối lượng peptide:
+ Protein mục tiêu phải ựứng ựầu bảng trong danh sách các peptide ựược so sánh tương ựồng trên dữ liệu.
+ Ít nhất có 5 peptide ựược phát hiện ựể cho sự so sánh tương ựồng có ý nghĩa.
1.4 đặc ựiểm sinh học và dinh dưỡng của ấu trùng tôm sú 1.4.1 Phát triển của ấu trùng tôm sú 1.4.1 Phát triển của ấu trùng tôm sú
Theo Holthius (1980) và Barnes (1987) trắch dẫn bởi Trần Ngọc Hải và ctv (1999) [12] thì tôm sú thuộc:
Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustacea Lớp: Malacostraca Lớp phụ: Eumalacostraca
Bộ: Decapod Họ: Penaeidae
Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon
Tôm sú tăng trưởng rất nhanh bằng cách lột vỏ, khoảng 4 - 5 tháng thì ựạt ựộ trưởng thành, trọng lượng khoảng 28 gam [42]. Tôm sú ựẻ quanh năm nhưng tập trung vào hai thời kỳ chắnh: tháng 3 - 4 và tháng 7 - 8 [39]. Sau khi tôm ựẻ từ 12 - 15 giờ, trứng nở ra ấu trùng [43]. Ấu trùng phát triển qua 3 giai ựoạn:
- Giai ựoạn Nauplius (N): chia thành 6 giai ựoạn phụ từ N1 ựến N6 và kéo dài khoảng 2 - 3 ngày [16]. Ấu trùng Nauplius mới nở dài khoảng 0,3 mm. Ấu trùng có tập tắnh trôi nổi, hướng quang và tự dưỡng bằng noãn hoàng nên không cần cho ăn [23].
- Giai ựoạn Zoea (Z): chia làm 3 giai ựoạn phụ từ Z1 ựến Z3 và kéo dài khoảng 4- 5 ngày [29]. Trong giai ựoạn này tôm tăng trưởng rất nhanh, cơ thể chia thành 2 phần rõ rệt: phần ựầu và phần bụng, xuất hiện mắt, chủy và gai trên mỗi ựoạn bụng. Cuối giai ựoạn này Zoea dài khoảng 3,2 mm. Ấu trùng Zoea-1 vẫn còn sử dụng noãn hoàn trong khi ựã bắt ựầu ăn ngoài [23], thức ăn chắnh là các loài tảo khuê như Skeletonema costatum, Chaetoceros sp., Tetraselmis sp., Nitzschia sp., vào thời kỳ Zoea-3 chúng ăn cả phiêu ựộng vật [41]. Trong sản xuất giống có thể cho ăn bổ sung thức ăn công nghiệp như Lansy, Frippak, tảo khô,Ầ hoặc thức ăn chế biến có kắch thước < 30 ộm.
- Giai ựoạn Mysis (M): chia làm 3 giai ựoạn từ M1 ựến M3 và kéo dài khoảng 3 - 4 ngày [16]. Mysis có hình dạng giống tôm con rất nhỏ, bơi ngửa và giật về phắa sau. Cuối giai ựoạn này Mysis dài khoảng 4,5 mm [23]. Mysis vẫn ăn tảo khuê nhưng bắt ựầu chuyển sang thức ăn ựộng vật, gồm ấu thể một số loài giáp xác và thân mềm, giun nhiều tơ, trùng bánh xe, ấu trùng Artemia,Ầ hoặc có thể bổ sung thức ăn công nghiệp (Lansy, Frippak) hay thức ăn chế biến có kắch thước 30 - 100 ộm.
Hình 1.9: Vòng ựời của tôm sú (Motoh, 1981)
- Giai ựoạn ấu trùng: mất khoảng 9 - 10 ngày, sau ựó biến thái thành hậu ấu trùng (Postlarvae) dài khoảng 5,2 mm [41]. Postlarvae có hình dạng giống hệt tôm trưởng thành. Postlarvae có khả năng bơi, bò và kẹp ựược thức ăn, có khuynh hướng chuyển xuống bám vào thành hoặc ựáy bể nuôi. Ngoài các loài tảo khuê, thức ăn chủ yếu cho giai ựoạn này là ấu trùng Artemia, thịt ựầu tôm, hàu nghiền nhỏ hay các ựộng vật phù du, sinh vật ựáy, mùn bã hữu cơ, bột trùnẦ Một số kết quả nghiên cứu gần ựây cho thấy sử dụng bột trùn có thể tạo ra tôm Postlarvae có chất lượng cao hơn so với các loại thức ăn thông thường. Giai ựoạn hậu ấu trùng kéo dài khoảng 20 - 25 ngày [16].
Sau ựó tôm chuyển sang thời kỳ ấu niên (Juvenile), chúng bơi lội ra biển, tiếp tục tăng trưởng và phát triển thành tôm trưởng thành, sinh sản và tiếp diễn chu kỳ sống. đối với tôm nuôi, thì giai ựoạn sau Postlarvae gọi là tôm giống.
1.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường ựến quá trình sống của ấu trùng tôm sú
Các yếu tố môi trường nước có ảnh hưởng rất lớn ựến sự phân bố, sinh sống, bắt mồi, tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm.
Nhiệt ựộ
Tôm sú thuộc loại ựộng vật máu lạnh nên nhạy cảm với sự thay ựổi về nhiệt ựộ, ựặc biệt là tôm ở giai ựoạn ấu trùng. Theo Vũ Thế Trụ (2000), nhiệt ựộ thắch hợp cho ấu trùng tôm sú phát triển là 27 - 30ồC [41] và theo Nguyễn Thanh Phương và ctv (1999) nhiệt ựộ 28 - 30ồC là thắch hợp nhất [22]. Nhiệt ựộ quá cao hay quá thấp hoặc thay ựổi ựột ngột quá 2ồC ựều gây bất lợi cho sự tăng trưởng của chúng.
độ mặn
Ấu trùng tôm sú có thể chịu ựược sự biến ựộng về ựộ mặn rất lớn 3-45Ẹ, nhưng ựộ mặn thắch hợp cho tăng trưởng của chúng là khoảng 27-30Ẹ [41], 28-30Ẹ [22]. Nếu ựộ mặn môi trường thay ựổi ựột ngột chênh lệch quá 3Ẹ dễ làm ấu trùng tôm nhiễm bệnh [41]. Oxy hòa tan
Oxy hòa tan trong nước là một yếu tố quan trọng trong ương nuôi ấu trùng tôm, nó ảnh hưởng lớn ựến tỷ lệ sống và tình trạng sức khỏe tôm. Sự thiếu dưỡng khắ là nguyên nhân gây ựột tử cao và nhanh nhất cho ấu trùng. để ấu trùng tôm tăng trưởng tốt, hàm lượng oxy hòa tan phải duy trì lớn hơn 5 ppm [41].
pH
pH thắch hợp nhất theo Bùi Quang Tề (2006) cho sự phát triển của ấu trùng tôm là 7,5 - 8,3 [28], theo Nguyễn Thanh Phương và ctv (1999) là 7,5 - 8,5 [22]. Khi pH lớn hơn 8,3 hầu hết ammonia chuyển thành dạng NH3 gây ựộc cho tôm, nhưng nếu pH nhỏ hơn 6,5 thì ựộ ựộc của H2S tăng lên (Boyd, 1992 trắch trong Phạm Hồng Thống, 2004) [31].
Ammonia
Ammonia hình thành do quá trình phân hủy bình thường của protein, xác bã thực vật phù du, thức ăn thừa, sản phẩm bài tiết của thủy sinh vật hay phân bón từ các nguồn vô cơ, hữu cơ. Việc ương nuôi các ựối tượng thủy sản trong hệ thống kắn thường dẫn ựến sự chuyển hóa và tắch tụ các chất thải trong môi trường.
Trong nước ammonia hiện diện dưới 2 dạng: dạng khắ NH3 và dạng ion NH4+. Trong ựó dạng khắ NH3 rất ựộc, ở nồng ựộ trên 1 ppm có thể gây chết tôm [23]. Khi pH và nhiệt ựộ tăng thì tỷ lệ phần trăm tổng NH3 cũng tăng. Theo Boyd (1998) hoặc Chanratchakool
(2003) trắch dẫn bởi Châu Tài Tảo (2005) hàm lượng ammonia thắch hợp cho nuôi tôm là 0,2 - 2,0 ppm [26].
Nitrite
Theo Phạm Văn Tình (1999), nồng ựộ nitrite dưới 1 ppm sẽ thắch hợp cho sự phát triển của ấu trùng tôm sú [38]. Ở nồng ựộ cao 4-5 ppm có thể ảnh hưởng bất lợi cho tôm [23].
1.4.3 Nhu cầu dinh dưỡng của tôm sú
Thức ăn là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho quá trình trao ựổi chất của tôm, do ựó thức ăn có vai trò quyết ựịnh ựến năng suất, sản lượng và hiệu quả của nghề ương tôm. Việc lựa chọn thức ăn phù hợp với từng giai ựoạn phát triển của tôm và ựảm bảo một số chỉ tiêu về tốc ựộ tăng trưởng, tỷ lệ sống luôn là vấn ựề tiên phong của nhà sản xuất giống. Nhìn chung, thức ăn cho tôm cần phải có ựầy ựủ các amino acid và acid béo không thay thế, các vitamin, chất khoáng và những chất cần cho sự phát triển khác ựồng thời phải ựảm bảo ựủ năng lượng ựể duy trì sự sống, hoạt ựộng bơi lội, tăng trưởng và sinh sản. Có thể phân chia các chất dinh dưỡng cần cho thức ăn tôm thành 5 nhóm chắnh là protein, lipid, carbohydrate, các vitamin và chất khoáng.
Protein
Protein ựược xem là yếu tố quan trọng hàng ựầu trong dinh dưỡng của tôm. Chế ựộ ăn nếu thiếu protein sẽ làm tôm chậm lớn và dễ bị bệnh [30]. Protein khi vào cơ thể tôm sẽ ựược phân giải thành các amino acid rồi ựược hấp thu qua thành ruột non ựể chuyển tới các tổ chức cơ thể.
Khi cung cấp protein cho tôm cần chú ý tới cả số lượng và chất lượng. Protein ựược ựánh giá là có giá trị cao khi trong thành phần có ựủ các amino acid thiết yếu ở tỷ lệ thắch hợp. Các amino acid thiết yếu cho tôm bao gồm: tryptophan, lysine, methionine, leucine, isoleucine, phenylalanine, threonine, valine, histidine và arginine [23], [30]. Những amino acid này cơ thể tôm không tự tổng hợp ựược hoặc tổng hợp với tốc ựộ không ựáp ứng nhu cầu cơ thể. Thiếu một trong các amino acid này sẽ dẫn tới rối loạn cân bằng ựạm và rối loạn sử dụng các amino acid còn lại [30]. Do ựó trong chế ựộ ăn cần cung cấp ựầy ựủ amino acid thiết yếu, theo Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải
(2004) tỷ lệ các amino acid trong thức ăn càng gần với tỷ lệ các amino acid của cơ thể tôm sẽ cho kết quả tăng trưởng tốt hơn [23].
Nhìn chung nhu cầu ựạm của tôm nhỏ cao hơn tôm trưởng thành. Theo Alava và Lim (1983) ựược trắch bởi Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải (2004), tôm giống có nhu cầu protein khoảng 40%, tôm thịt khoảng 35 - 40%, còn theo Nguyễn Văn Thoa và Bạch Thị Quỳnh Mai (1996) thì hàm lượng protein trong thức ăn cho ấu trùng tôm phải