B. độ bền pH các phân ựoạn enzyme sau khi tinh sạch
3.20 So sánh trình tự amino acid FIII-2 trùn quế với Lumbrokinase
Eisenia fetida (EU167737), serine protease Mus.musculus (P69525), tiền chất Lumbrokinase của Lumbricus
rubellus (U25647) và Eisenia fetida (AY438624).
(*) Các amino acid hoàn toàn giống nhau ; (. ) Các amino acid có cấu trúc 3D tương tự nhau, có thể thay thế cho nhau mà không ảnh hưởng ựến cấu trúc và chức năng của protein
Kết quả cho ở hình 3.19 và 3.20 cho thấy FIII-1 và FIII-2 có sự tương ựồng cao với protease thủy phân fibrin Lumbrokinase (EC 3.4.21) từ các loài trùn ựất Lumbricus
rubellusvàEisenia fetida. Trong ựó, FIII-2 có mức ựộ tương ựồng với FII Lumbrokinase
của Lumbricus rubellusvới tỷ lệ khá cao và có giá trị ựáng tin cậy. FII của lumbrokinase
có khối lượng phân tử là 26kDa với 242 amino acid, khả năng tương ựồng với ựoạn peptide khảo sát của FIII-2 ựạt 16,9% tống số amino acid ựược so sánh có mức ựộ cao hơn so với FIII-1(13,2%).
Các kết quả trên cho thấy các ựoạn peptide phân tắch ựược ựều có mối liên quan với các loài trùn ựất khác và dựa trên trình tự amino acid ựã biết có thể thiết kế các ựoạn mồi ựể sử dụng trong kỹ thuật PCR phân lập gen mã hóa cho các protease này ở giai ựoạn nghiên cứu tiếp theo.
Ngoài ra FIII-1 và FIII-2 cũng có trình tự amino acid tương ựồng với các enzyme thuộc nhóm serine protease của một số loài khác, mặc dù mức ý nghĩa tin cậy không cao nhưng cũng khẳng ựịnh thêm rằng các phân ựoạn enzyme ựã tinh sạch ựều liên quan ựến nhóm serine protease như ựã chứng minh trong phần khảo sát tắnh chất (3.4.1 và 3.4.2)
Vì ựây là kỹ thuật phân tắch mới, ựiều kiện không thể thực hiện trực tiếp ựược nhưng chúng tôi có thể ghi nhận ựược những lý do ựưa ựến kết quả chưa ựược như mong muốn như sau:
+ Quá trình xử lý mẫu mặc dù có thực hiện giai ựoạn khử cầu disulfide và alkyl hóa nhóm SH ựể tắnh tóan khối lượng peptide chắnh xác nhưng vẫn không thể so sánh ựược nhiều ựoạn peptide trên website ựể ựạt ựến mức ựộ có ý nghĩa theo quy luật.
+ Lượng protein quá thấp trên gel ựiện di hai chiều, lại qua nhiều giai ựoạn xử lý mẫu như thủy phân, loại muối và cô ựặc mẫu nên mẫu thu ựược ắt, vì vậy phổ peptite nhận ựược không có ựộ phân giải tốt (FI-a, FI-b, FII, FIII-3b, FIV)
+ Phân ựoạn FIII-3b còn lẫn tạp chất của keratin trong qúa trình xử lý mẫu vì thế phân ựoạn này cho kết quả không ựủ tin cậy.
Qua các kết quả nghiên cứu cơ bản trên hệ protease trùn quế tự phân chúng tôi nhận ựịnh có thể mở ra hai hướng ứng dụng về hệ enzyme này:
Hướng thứ nhất: trong y dược có khả năng sử dụng làm thuốc ựể thủy phân các cục máu nghẽn sau khi nghiên cứu thêm phần ựộc tắnh cấp và ựộc tắnh bán trường diễn trên ựối tượng ựộng vật trước khi sử dụng cho người.
Hướng thứ hai: trong nuôi trồng thủy sản tiến hành tự phân trùn quế nhằm tạo ra nguồn bột ựạm có chứa hàm lượng ựạm amine cao ựể sử dụng cho các ựối tượng ấu trùng có hệ tiêu hóa chưa hoàn chỉnh. Trong phạm vi ựề tài chúng tôi ựã nghiên cứu ứng dụng sản xuất bột ựạm cao cấp dùng nuôi ấu trùng tôm sú là ựối tượng hiện ựang ựược ngành thủy sản quan tâm ựồng thời giải quyết ựầu ra cho trùn quế ựang ựược nuôi một cách rộng rãi và ựại trà như hiện nay.
3.3. Khảo sát các ựiều kiện tối ưu ựể thu nhận bột trùn quế tự phân
Thông thường các yếu tố pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ enzyme và cơ chất, lượng nước bổ sung, thời gian thủy phân ảnh hưởng ựến tốc ựộ phản ứng enzyme nên cũng tác ựộng ựến quá trình tự phân giải trùn quế. Vì vậy, thắ nghiệm ựặt ra nhằm xác ựịnh các ựiều kiện thắch hợp ựể quá trình tự phân giải ựạt hiệu suất thủy phân cao nhất ựồng thời tìm chế ựộ sấy dịch tự phân phù hợp tạo bột ựạm ựạt chất lượng tốt.
3.3.1 Khảo sát pH thắch hợp cho quá trình tự phân
Thắ nghiệm ựược bố trắ với gắa trị pH tăng dần từ pH 6,0 ựến pH 13,0 bằng cách sử dụng các dung dịch ựệm khác nhau: phosphate (pH 6, 7, 8); glycine-NaOH (pH 9, 10, 11) và KCl-NaOH (pH 12, 13) nhằm mục ựắch tìm ra giá trị pH tối ưu cho quá trình tự phân giải. Kết quả ựược thể hiện trên biểu ựồ hình 3.21 cho thấy sau 5 giờ tự phân hệ protease trùn quế hoạt ựộng tốt ở pH kiềm, tương tự như hệ protease loài trùn Lumbricus rubellus
Hàn Quốc và Nhật Bản [46], [65]. Tác giả Nakajima Nobuyoshi và ctv. (2000) còn cho biết các protease trùn Lumbricus rubellus có khả năng thủy phân nhiều cơ chất protein khác nhau như elastin, hemoglobin, fibrin, caseine, collagen, albumin, keratin và ựặc biệt là có khả năng tự phân giải chắnh protein của nó. Theo Nguyễn Hữu Chấn (1983) và Nguyễn đức Lượng (2004), pH tối ưu của enzyme có thể thay ựổi tùy theo bản chất của cơ chất [4], [19]. Kết quả cũng này cũng phù hợp khi nghiên cứu chiết tách và tinh sạch protease trùn quế có pH tối ưu trên cơ chất casein là trong khoảng kiềm 10 - 12. Như
vậy, có thể thấy pH tối ưu cho hoạt ựộng của protease trùn quế trên cơ chất protein của nó tương tự như trên casein. Dựa vào biểu ựồ có thể xem pH tối ưu cho quá trình tự phân trùn quế là 10, tương ứng với hàm lượng ựạm amine 42,39 mg/g và hiệu suất thủy phân 37,95%. 0 10 20 30 40 6 7 8 9 10 11 12 13 pH H iệ u s u ấ t th ủ y p h â n ( N % )