Nhằm tìm ra loại gel và trình tự các bước sắc ký ựể tinh sạch các protease trong trùn quế.
Khảo sát chọn gel trao ựổi ion âm
Dựa vào khoảng pI từ thắ nghiệm khảo sát sơ bộ tiến hành hòa tan tủa protein trong ựệm 20mM Tris-HCl pH 8,5 + 1mM PMSF. Sau ựó cho dịch enzyme thô lần lượt lên cột chứa gel DEAE và Unosphere Q với tốc ựộ dòng 0,8ml/phút. Thu nhận protein không hấp phụ trên gel qua cột. Sau ựó giải hấp phụ protein bị giữ trên gel bằng gradient nồng ựộ muối 0-0,45 M NaCl, tốc ựộ dòng 1 ml/phút. Kiểm tra hoạt tắnh protease phần protein không hấp phụ và các phân ựoạn protein thu nhận ựược sau khi giải hấp phụ.
Sắc ký trao ựổi ion trên cột Unosphere Q
10 g protein thô hòa tan trong 100 ml ựệm 20 mM Tris-HCl pH 8,5 + 1 mM PMSF. Cột sắc ký 1,5 x 40 cm ựược nhồi gel Unosphere Q, cân bằng với ựệm 20 mM Tris-HCl pH 8,5 + 1 M PMSF. Dung dịch protein ựược cho qua cột với tốc ựộ dòng 0,8 ml/phút. Protein hấp phụ ựược rửa bằng gradient nồng ựộ muối 0-0,045 M NaCl, tốc ựộ dòng 1
ml/phút. Thu các phân ựoạn protein, xác ựịnh hàm lượng protein, xác ựịnh hoạt tắnh protease trên casein theo phương pháp Anson cải tiến và chạy ựiện di trên gel polyacrylamide có SDS và chất khử β-mercaptoethanol mỗi giếng khoảng 20ộg protein.
Sắc ký tương tác kỵ nước trên cột phenyl sepharose
Các phân ựoạn protease có hoạt tắnh thu nhận ựược sau khi qua cột sắc ký trao ựổi ion, tiếp tục cho qua cột sắc ký tương tác kỵ nước. Cột (1,5 x 30 cm) ựược nhồi gel Phenyl Sepharose. Cân bằng cột với ựệm 20 mM Tris-HCl pH 8,5 + 1 mM PMSF + 13% ammonium sulphate (AS) tốc ựộ dòng 1,0 ml/phút. Các phân ựoạn ựược tuần tự cho qua cột. Protein hấp phụ ựược rửa với gradient nồng ựộ muối 30-0% ammonium sulphate, tốc ựộ dòng 1 ml/phút. Thu các phân ựoạn protein, xác ựịnh hàm lượng protein, xác ựịnh hoạt tắnh protease trên casein theo phương pháp Anson cải tiến và chạy ựiện di trên gel polyacrylamide có SDS và chất khử β-mercaptoethanol mỗi giếng khoảng 20ộg protein.
Sắc ký lọc gel trên cột Superose 12
Các phân ựoạn có hoạt tắnh protease thu ựược từ sắc ký tương tác kỵ nước ựược thẩm tắch loại muối trong ựệm 20 mM Tris-HCl pH 7,5 + 10 mM PMSF. Từng phân ựoạn ựược cho tuần tự qua cột lọc gel Superose 12 (Amersham), sử dụng hệ thống sắc ký tự ựộng Biologic HR (Bio-Rad) với cùng dung dịch ựệm, tốc ựộ dòng chảy 0,5 ml/phút. Protein sau khi giải hấp phụ ựược thu lại, xác ựịnh hàm lượng protein, hoạt tắnh protease trên casein và ựiện di SDS-PAGE mỗi giếng khoảng 20ộg protein.
Các phân ựoạn enzyme sau khi tinh sạch ựược thẩm tắch loại muối và ựông khô lạnh bằng thiết bị VirTis (Mỹ).
điện di
Kỹ thuật SDS-PAGE theo Hames (1998) với gel polyacrylamide 12% (Phụ luc 1.5) [54]. Xác ựịnh khối lượng phân tử của protein dựa trên thang protein chuẩn của Fermentas gồm : lysozyme (14,4kDa) ; β-lactoglobulin (18,4kDa); restriction
endonuclease Bsp 98I (25kDa); lactate dehydrogenase (35kDa); ovalbumin (45kDa); bovin serum albumin (66,2kDa); β-galactoside (116kDa).
Khối lượng phân tử một protein ựược tắnh từ ựường chuẩn bằng cách lấy log Mr với hệ số Rf của các protein chuẩn.