Trong quá trình thủy phân protein thông số theo dõi phản ứng là hiệu suất thủy phân. Hiệu suất thủy phân ựược xác ựịnh là % của lượng nitơ ựạm amine tạo ra trong dịch thủy phân trên lượng nitơ của ựạm tổng số [79].
MN x100 Trong ựó : Hiệu suất thủy phân (N%) =
MN tổng số N: hiệu suất thủy phân (%)
MN: lượng nitơ ựạm amine dịch thủy phân MN tổng số : lượng nitơ ựạm tổng số
Một vài phương pháp thông dụng ựể theo dõi hiệu suất thủy phân là pH-stat, chuẩn ựộ formol, ựo ựộ nhớt, xác ựịnh hàm lượng nitơ hòa tan hoặc xác ựịnh hàm lượng nhóm amine bằng phương pháp Trinitro-benzene sulfonic acid (TNBS) hoặc phương pháp ortho-phthaldialdehyde. Mỗi phương pháp ựều có những ưu và nhược ựiểm khác nhau, những phương pháp xác ựịnh nhanh có thể cho ựộ chắnh xác không cao. Sau ựậy là bảng tóm tắt nguyên tắc các phương pháp xác ựịnh hiệu suất thủy phân protein thông dụng.
Bảng 1.2 Nguyên tắc các phương pháp xác ựịnh hiệu suất thủy phân
Phương pháp Nguyên tắc Tham khảo
pH-stat
đo ựộ nhớt Chuẩn ựộ formol TNBS
OPA
Giữ pH không ựổi suốt tiến trình thủy phân, số lượng base sử dụng tỉ lệ với lượng amine tạo ra
Theo dõi sự thay ựổi ựộ nhớt bằng máy ựo ựộ nhớt Chuẩn ựộ nhóm amine với formadehyde
2,4,6-Trinitro-benzene sulfonic acid phản ứng với nhóm amine tạo hợp chất có màu
Ortho -phthaldialdehyde phản ứng với nhóm amine bậc 1 tạo hợp chất hấp thụ ở bước sóng 340nm [86] [86] [79] [88] [87]
1.3 Kỹ thuật thu nhận, tinh sạch và phân tắch protein hiện ựại
Protein là hợp chất hữu cơ cao phân tử, do tế bào sống tổng hợp nên và hoạt ựộng tốt trong môi trường cơ thể chắnh nó. Trong thực tế ựể ứng dụng protein có hoạt tắnh sinh học một cách hiệu quả, chẳng hạn ựối với protein là enzyme do chúng không những xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi nó vẫn có thể hoạt ựộng cho các phản ứng ở ngoài tế bào. Vì thế việc tinh sạch protein nhằm hiểu rõ hơn về tắnh chất lý hóa học của nó như khối lượng phân tử protein, nhiệt ựộ và pH tối ưu, ựộ bền pH, nhiệt ựộ theo thời gian, các tác dụng sinh lý trên invitro là ựiều không thể thiếu trong các nghiên cứu cơ bản.
Ngày nay, với sự phát triển các thiết bị và kỹ thuật tiên tiến giúp cho các phương pháp phân tắch, tinh sạch những hợp chất có phân tử lượng lớn ngày càng trở nên dễ dàng hơn. đặc biệt trong lĩnh vực tinh sạch protein với hàm lượng nhỏ ựược thực hiện, ngoài ý nghĩa trên chúng còn ựược nghiên cứu sâu hơn về sự biến ựổi sau giải mã và chức năng sinh học của protein [107].
Các protein có hoạt tắnh sinh học sau khi tinh sạch sẽ ựược thủy phân bằng các enzyme cắt ựặc hiệu. Sau ựó dùng kỹ thuật sắc ký tách các ựoạn peptide và giải trình tự amino acid các ựoạn peptide này theo phương pháp Edman. Hiện nay việc phân tắch này có thể tiến hành nhanh hơn với lượng mẫu phân tắch rất nhỏ nhờ phương pháp phổ khối lượng MS-MS hoặc MALDI-TOF. Tiếp theo việc xác ựịnh này là giải trình tự nucleotide của ựoạn gen mã hóa cho ựoạn peptide trên, tiến xa hơn nữa là sản xuất enzyme, kháng thể, vacxinẦ bằng con ựường công nghệ sinh học. Bên cạnh ựó, việc tinh sạch protein ựể nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều dạng tinh thể bằng kỹ thuật X-Ray nhằm xác ựịnh mối quan hệ giữa chức năng và cấu trúc phân tử protein hoặc cơ chế xúc tác của enzyme cũng là một trong những vấn ựề hiện nay ựược các nhà khoa học quan tâm.
Như vậy một nghiên cứu cơ bản về tinh sạch protein cần ựi theo trình tự các bước từ thu nhận, tìm kỹ thuật tinh sạch, kiểm tra hoạt tắnh, xác ựịnh các ựặc tắnh hóa học và phân tắch sâu hơn là trình tự amino acidẦ.Trong mỗi bước cần phải chú ý ựến các ựiều kiện và kỹ thuật cụ thể ựể thu ựược một protein còn hoạt tắnh sinh học, có ựộ tinh sạch cao.