Serine protease có chung nhóm phân loại EC 3.4.21 là một trong số các enzyme ựược nghiên cứu khá rộng rãi ngoài khả năng thủy phân protein trong quá trình tiêu hóa của ựộng vật phổ biến nhất là trypsin, chymotrypsin và elastase. Serine protease còn tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý trong cơ thể như phá cục máu nghẽn và họat hóa các bổ thể [62]. Trung tâm hoạt ựộng của nhóm enzyme này chứa các amino acid aspartic, histidin và serine trong ựó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế ựược trình bày hình 1.2.
Hình 1.2: Sơ ựồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease
(1)
(2)
(3)
Cơ chế theo hình 2.1 gồm 3 phản ứng:
Phản ứng 1: nhóm -OH của serine trong trung tâm hoạt ựộng enzyme kết hợp với nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ diện (tetrahedral complex).
Phản ứng 2: ở trạng thái phức hợp chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển ựiện tắch lên O tạo nhóm C=O mới làm ựứt liên kết peptide giải phóng mạch polypeptide ựầu N và hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme mới.
Phản ứng 3: với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide ựầu C còn lại và khôi phục trung tâm hoạt ựộng của serine protease.
Như vậy ngoài cơ chế chung các enzyme thuộc nhóm này có tắnh chất cắt riêng biệt là do trong phân tử protein có một Ộtúi Ộ (pocket) luôn ựược ựịnh vị gần trung tâm hoạt ựộng nhóm serine (Hình 1.3).
Hình dạng và sự tắch ựiện của túi khác nhau sẽ cho các vị trắ cắt chuyên biệt của từng serine protease khác nhau [80]
Chymotrypsin với túi chỉ chứa các nhánh amino acid kỵ nước cồng kềnh vì vậy nhóm này chỉ thắch hợp với các mạch bên R của phenylalanin, tryptophan, tyrosine của chuỗi polypeptide.
Trypsin với túi chứa aspartic ở vị trắ trong cùng nên chỉ thắch hợp với các mạch bên R của amino acid tắch ựiện dương như arginine, lysine.
Elastase với túi chứa hai phân tử valin nên chỉ chứa ựủ các amino acid của mạch bên R như glycine, alanine và valine
Plasmin thuộc nhóm serine protease (EC 3.4.21.7) là enzyme quan trọng có mặt trong máu ựể thủy phân các cục máu nghẽn fibrin, hoạt ựộng giống trypsin có khả năng thủy phân liên kết peptide có mạch bên R của arginine và lysine trong chuỗi polypeptide. Ngoài việc thủy phân fibrin, plasmin còn thủy phân cả những protein trong các hệ thống khác như hoạt hóa collagenase, một vài chất ựiều hòa của hệ thống bổ thể và làm yếu vách tế bào của nang Graafian dẫn ựến sự rụng trứng.
1.2.3 Ứng dụng nhóm serine protease trong quá trình thủy phân fibrin
1.2.3.1 Khái quát về phân tử fibrinogen, fibrin
Fibrinogen và fibrin ựiều khiển sự cân bằng trong việc cầm máu của cơ thể. Chúng ựóng vai trò quan trọng trong việc duy trì ựộ nhớt của máu ở ựiều kiện bình thường và cầm máu khi cơ thể bị tổn thương [98].
a. Cấu trúc phân tử fibrinogen
Cấu trúc phân tử fibrinogen ựã ựược mô tả vào năm 1959 bởi Hall và Stayter trắch dẫn bởi Fuss C. và ctv. (2001) [65], nó là phân tử có chiều dài 47,5ổ2,5nm có 3 nút nhỏ theo hình 1.4. Hai nút ngoài gọi là các domain tận cùng (cuối) với ựường kắnh khoảng 6,5nm và một domain trung tâm khoảng 5nm, chúng nối với nhau
bằng một sợi nhỏ hơn với chiều dày 1,5nm có cấu trúc xoắn cuộn.
Cuối những năm 1970 cấu trúc phân tử fibrinogen ựã ựược xác ựịnh rõ ràng hơn, chúng có khối lượng phân tử 340.000Da [78]. Phân tử fibrinogen gồm một domain trung tâm và hai domain nhánh. Mỗi domain nhánh ựều chứa ba chuỗi polypeptide có tên là Aα, Bβ và γ tương ứng với 610, 461 và 411 gốc amino acid (Hình 1.5).
Domain trung tâm là nơi liên kết hai domain nhánh bằng cách tập hợp 3 gốc amine tự do của mỗi domain nhánh. đầu amine của mạch Aα, Bβ có hai ựoạn peptide A và B, khi chúng bị tách ra khỏi domain trung tâm sẽ có sự chuyển ựổi fibrinogen thành monomer fibrin. đoạn ựầu của domain nhánh (gần domain trung tâm) có 3 trong số 11 liên kết disulfide, ựoạn cuối domain nhánh sẽ chứa 8 liên kết disulfide còn lại, ựược ựịnh vị giữa hai mạch Aα, Bβ và nối liền giữa domain trung tâm và các cuộn xoắn của domain nhánh. Những cuộn xoắn này bao gồm các mạch ựơn của 3 chuỗi Aα,Bβ và γ siêu cuộn lại như xoắn α. Các liên kết disulfide trong mỗi cuộn xoắn chịu trách nhiệm cho cấu trúc siêu xoắn và cho việc nối domain trung tâm và các domain nhánh dưới dạng các vòng
Hình 1.5: Cấu trúc phân tử fibrinogen (Mander, 1982)
Phần phụ phân cực Aα Vòng disulfide
Cụm carbohydrate Thùy γ
disulfide. Việc ựịnh hướng các gốc amino acid trong cấu trúc phân tử fibrinogen luôn luôn là: bên trong cuộn xoắn chứa các gốc kỵ nước và bên ngoài là các gốc phân cực Các domain nhánh có khối lượng phân tử 67.200Da, hầu hết cấu trúc chủ yếu trong các domain này ựược hiển thị bằng các nếp gấp ngẫu nhiên của các mạch γ và β tương ứng ựược gọi là thùy (lobe) γ và β. Ngoài ra, các domain nhánh còn có bốn cụm carbohydrate, mỗi cụm khoảng 2.500Da, hai cụm ựịnh vị trên mạch β ở mỗi domain nhánh và hai cụm nằm trên mạch γ ở mỗi nhánh gần domain trung tâm. Phần phụ phân cực Aα là vị trắ ựể tạo các liên kết chéo trong phân tử fibrin và chúng nằm gần ựầu cuối carboxyl của mạch γ.
b. Sự polymer hóa fibrinogen tạo fibrin
Sự polymer hóa fibrinogen ựược thực hiện khi có mặt của thrombin. Thrombin có nhiệm vụ tạo thành sợi fibrin không hòa tan từ fibrinogen. đầu tiên là thành lập các monomer fibrin, bằng việc cắt hai ựoạn peptide A và B từ ựầu cuối amin của mạch Aα và Bβ bởi thrombin [65], [66]. Việc loại bỏ ựoạn peptide của fibrinogen dẫn ựến sự polymer hóa tự phát các monomer fibrin thành fibrin, vì
khi loại bỏ peptide A lộ ra một ựiểm polymer hóa ựầu amin của mạch α với trình tự của Gly-Pro-Arg. Vị trắ này sẽ tương tác với một vị trắ tương thắch trên thùy γ của domain nhánh. Trên hai cạnh ựối nhau của phân tử, peptide B cũng lộ ra ựầu amine của của mạch β với trình tự của Gly-His-Arg, vị trắ này sẽ tương tác với một vị trắ bổ sung thùy β của domain nhánh. Phản ứng khởi ựầu này tạo một dimer, từ ựó có thể kết hợp với các monomer fibrin khác tạo thành một protofibril.
Hình 1.6: Tiến trình polymer hóa fibrinogen tạo fibrin
Fibrinogen
Monomer
Dimer
Protofibril
Các liên kết chéo của protofibril bắt ựầu chuyển hóa yếu tố cảm ứng thrombin (yếu tố XIII) tạo thành enzyme transglutaminase gọi là yếu tố XIIIa có khả năng liên kết các mạch bên của lysine và glutamine bằng các liên kết peptide giữa các mạch protofibril, khoảng 6 liên kết có thể gắn kết các monomer fibrin kề nhau. Ban ựầu liên kết chéo nhanh chóng cuộn các mạch γ thành hai phân tử fibrin thẳng hàng theo kiểu ựối dịên và song song với nhau (hình 1.6). Sau ựó, là các mạch α liên kết lại tạo nên một kiểu liên kết chéo phức tạp tương ứng với sự tạo thành các sợi fibrin dày có ựộ ựàn hồi lớn và bị phân giải bởi plasmin.
c. Sự phân giải fibrinogen và fibrin
Trong cơ thể, sự thủy phân sợi fibrin không chỉ cần thiết trong việc làm lành vết thương mà còn giới hạn khả năng lan rộng sự vón cục máu. Giữ vai trò quan trọng trong chức năng cầm máu là sự hoạt hóa plasminogen thành plasmin và sự tương tác của chúng với fibrinogen và fibrin. Plasminogen tồn tại dưới hai dạng là Glu-plasminogen và Lys- plasminogen. Dạng Glu-plasminogen khi
chưa bị phân cắt có ựầu amine chứa acid glutamic vì vậy ựược gọi là Glu- plasminogen. Khi có mặt của plasmin, Glu-plasminogen bị cắt ở vị trắ Lys76-Lys77 tạo thành Lys-plasminogen [110] và loại này có ái lực cao ựối với fibrin hơn Glu- plasminogen [53]. Cả hai dạng của plasminogen này có thể bị phân cắt ở liên kết peptide Arg560-Val561 bởi uPA (chất hoạt hóa plasminogen urokinase) hoặc tPA (chất hoạt hóa plasminogen của mô) tạo thành plasmin [101]. Cả hai dạng plasminogen ựều có hai vị trắ gắn với
monomer fibrin, một có ái lực cao và một Hình 1.7 : Mô hình phân giải fibrinogen bởi plasmin (Mander, 1982) Mảnh X Mảnh Y Mảnh E Mảnh D Fibrinogen
có ái lực thấp. Bằng việc tương tác với fibrin, phắa có ái lực thấp hoạt hóa plasminogen gấp 5 lần so với phắa có ái lực cao.
Fibrin và fibrinogen ựều bị phân giải bởi plasmin, là enzyme thuộc nhóm serine protease chuyên thủy phân liên kết peptide có mạch bên arginyl và lysyl trong cấu trúc cuộn xoắn. Tiến trình phân giải fibrinogen theo thứ tự ựược mô tả ở hình 1.7. Theo Mander sản phẩm trung gian là các mảnh X và Y. Mảnh X là kết quả từ việc loại bỏ phần phụ phân cực Aα khỏi fibrinogen, mảnh Y là kết qủa từ việc cắt cuộn xoắn giữa ựoạn của domain trung tâm và domain nhánh tạo ra mảnh D và Y. Việc cắt xa hơn nữa mảnh Y lại tiếp tục tạo ra mảnh D và E.
Những bước phân giải này cũng tương tự cho fibrin không có các liên kết chéo. Cũng có thể dự ựóan nếu có liên kết chéo thì sản phẩm của sự thủy phân fibrin sẽ có sự khác biệt. Khi có các liên kết chéo thì sự phân giải fibrin sẽ chậm lại và tạo các dẫn suất khác nhau rất phức tạp trong suốt quá trình hòa tan cục máu ựông.
1.2.3.2 Vai trò của enzyme thủy phân fibrin trong ựiều trị tim mạch
Như ựã ựề cập về hoạt ựộng của hệ thống fibrinogen và fibrin trong cơ chế cầm máu. Ở các mô bình thường, luôn có sự cân bằng ựộng giữa hai quá trình này. Trong hầu hết các bệnh về tim mạch như tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc ựộng mạch phổi người ta ựều thấy nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch là do các cục máu ựông lưu giữ trong mạch. Nhưng nếu quá trình thủy phân fibrin tăng bởi nguyên nhân bệnh lý sẽ dẫn ựến hậu quả chảy máu quá mức. Trong thực tế, việc xử lý bệnh nghẽn mạch ựều dựa vào việc sử dụng các chất kháng ựông hóa học như heparin và coumadin ựể kìm hãm sự tạo thành các cục máu fibrin. Các nghiên cứu lâm sàng ựã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất ựể ựiều trị chứng nghẽn mạch là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin, nói cách khác là các chất hoạt hóa plasminogen. Hiện nay các enzyme thường ựược sử dụng trong ựiều trị này là streptokinase (từ vi khuẩn
Streptococcus haemolyticus), urokinase (từ nước tiểu của người) và tPA tái tổ hợp. Việc sử dụng các enzyme này tương ựối hiệu quả, nhưng nó vẫn chưa thể giải quyết ựược hết các vấn ựề nảy sinh trong quá trình ựiều trị bệnh nghẽn mạch. Việc ựiều trị bằng
streptokinase có tác dụng phụ là gây sốt cho bệnh nhân, có xu hướng tăng chảy máu, tạo kháng nguyên và khó có thể xác ựịnh liều lượng thắch hợp [61]. tPA tái tổ hợp và urokinase tuy không có vấn ựề miễn dịch như ựối với streptokinase nhưng giá thành lại rất ựắt.
Do các tồn tại trên và nhu cầu chữa bệnh nghẽn mạch là rất lớn nên các nhà nghiên cứu ựã tìm kiếm những tác nhân tự nhiên có thể phân giải trực tiếp cục máu ựông gây nghẽn mạch, có tác dụng thủy phân fibrin như plasmin có trong cơ thể. Họ cho rằng enzyme thủy phân trực tiếp fibrin có thể khắc phục ựược những vấn ựề còn tồn tại ựối với các loại thuốc ựã sử dụng. Do ựó việc dò tìm các enzyme thủy phân trực tiếp fibrin làm thuốc chữa bệnh tim mạch ựã tỏ ra có nhiều triển vọng và ngày càng mở rộng trên nhiều ựối tượng khác nhau từ nước tiểu ở người, ựộng vật, thực vật cho ựến vi sinh vật.
1.2.3.3 Các nghiên cứu về enzyme thủy phân fibrin
Enzyme thủy phân fibrin có nguồn gốc từ ựộng vật: Loài trùn ựất Lumbricus rubellus
ựã ựược phát hiện tại Nhật [81], [82], có khả năng thủy phân mạnh fibrin và sau ựó ựược tinh sạch gồm 6 isozyme ựều có khả năng ựó và ựược ựặt tên là Lumbrokinase. Tiếp theo là các nghiên cứu trên lọai trùn này ở Hàn Quốc [46], [47] cũng ựã tinh sạch, khảo sát các ựặc ựiểm, giải trình tự nucleotide và nhân dòng gen mã hóa lumbrokinase có hoạt tắnh thủy phân fibrin cao. Năm 1997, Yang J.S ựã tách chiết enzyme thủy phân fibrin ựược hoạt hóa bởi SDS có nguồn gốc từ loài trùn ựất Eisenia fetida [112]. Bằng các kỹ thuật sắc ký trên gel DEAE sepharose, sephadex G-75 và phenyl sepharose ựã tinh sạch ựược loại enzyme có khối lượng phân tử 45kDa gồm hai tiểu ựơn vị, tiểu ựơn vị lớn 26kDa và tiểu ựơn vị nhỏ 18kDa gắn kết với nhau bằng các liên kết tương tác kỵ nước. Enzyme thủy phân fibrin ựược tách chiết từ sâu bướm Lonomia achelous ở Venezuela bởi Coll-Sangrona. E và ctv (1998) [52] có hoạt tắnh khoảng 100 ựơn vị urokinase/mL. Enzyme này có khả năng phân hủy các cục máu ựông với tốc ựộ chậm hơn so với sự thủy phân của plasmin. Các vị trắ cắt của enzyme này trên phân tử fibrinogen khác với các vị trắ cắt của plasmin.
Dametto và ctv, năm 2000 ựã tinh sạch ựược enzyme giống trypsin có khả năng thủy phân fibrin từ một giống ruồi Haematobia irrtans. Bằng cột sắc ký ái lực chuyên biệt
SBTI-sepharose ựã tách ựược enzyme có khối lượng phân tử 25,5 kDa hoạt ựộng ở pH tối ưu bằng 9 và thủy phân ựược cơ chất tổng hợp H-D Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide ựặc trưng cho enzyme giống trypsin và có thể thủy phân cả fibrinogen và fibrin với hoạt tắnh rất cao [93].
Enzyme thủy phân fỉbrin từ vi sinh vật: Năm 1987, Sumi sau nhiều năm nghiên cứu về enzyme phân giải cục máu nghẽn và tìm kiếm tác nhân tự nhiên có thể hòa tan cục nghẽn liên quan ựến nhồi máu cơ tim ựã phát hiện ra nattokinase cũng là một enzyme có khả năng thủy phân fibrin mạnh. Nattokinase ựược chiết tách và tinh sạch từ ựậu nành lên men có tên gọi Natto, là một lọai thực phẩm truyền thống của Nhật Bản. Quá trình lên men ựược bổ sung vi khuẩn Bacillus natto vào dịch ựậu nành ựã ựược nấu chắn và chắnh lọai vi khuẩn này sản sinh enzyme nattokinase [114].
Tiếp theo là hàng loạt các nghiên cứu trên ựối tượng vi sinh vật ở Hàn quốc, Kim W.K và ctv (1996) ựã tinh sạch enzyme thủy phân fibrin từ Bacillus sp CK 11-4 ựược chiết tách từ nước sốt ựậu nành lên men [75]. Một nghiên cứu khác của Kim H.K và ctv cũng tinh sạch và khảo sát các ựặc ựiểm thủy phân fibrin từ Bacillus sp KA38 có nguồn gốc từ cá muối lên men [73]. Douchi là loại thực phẩm lên men từ ựậu nành Trung Quốc cũng ựược Wang và ctv (2006) ựã chiết tách và xác ựịnh các tắnh chất một enzyme thủy phân mạnh fibrin và fibrinogen từ chủng Bacillus subtilis DC33 có khối lượng phân tử khoảng 30kDa, với hoạt tắnh 418 IU cho mỗi ml môi trường nuôi cấy LB [117].
Một enzyme thủy phân fibrin có tắnh chất giống chymotrypsin thuộc nhóm protease kim loại, bị kìm hãm bởi EDTA và EGTA cũng ựược phát hiện bởi Park và ctv năm 2007, tinh sạch từ môi trường lên men nấm Flammulina velutipes [90].
Enzyme thủy phân fibrin có nguồn gốc từ thực vật: Việc nghiên cứu các enzyme có hoạt tắnh thủy phân fibrin cao không chỉ dừng lại ở các ựối tượng ựộng vật và vi sinh vật mà còn khai thác cả trên thực vật. Choi và Sa (2001) ựã tách chiết và khảo sát ựặc tắnh của enzyme thủy phân fibrin từ loài bèo tấm Spirodela polyzhira là loại enzyme có hai sợi polypeptide với khối lượng phân tử 145kDa và 70kDa. Với khả năng thủy phân ựược không những cơ chất fibrinogen, fibrin mà còn có hoạt tắnh kháng thrombin. Vì vậy có thể sử dụng trong ựiều trị lâm sàng ựối với bệnh nghẽn mạch [53]. Kim J.S và ctv (2006)
ựã tinh sạch enzyme protease trung tắnh từ loại nấm ăn chữa bệnh Cordyceps militaris
(Hàn Quốc) với khối lượng phân tử 52 kDa có khả năng thủy phân nhanh mạch α, mạch γ-γ của fibrin và thủy phân mạch β fibrin nhưng chậm hơn [14].
Như vậy với vai trò quan trọng của nhóm enzyme thủy phân fibrin trong ựiều trị bệnh