Các ựiểm protein cắt trên gel ựiện di một chiều (phân ựoạn FIII-3a và FIII-3b) và hai chiều (các phân ựoạn còn lại) ựược xử lý qua các giai ựoạn thủy phân bằng trypsin ựặc hiệu, khử cầu nối disulfide và alkyl hóa nhóm SH theo protocol của trung tâm proteomic
đại Học Quốc gia Singapor (xem phụ lục 1.7.1) và phân tắch bằng kỹ thuật khối phổ MALDI-TOF-TOF. Kết quả ựược phân tắch bằng phần mềm BLASTP 1.4.0, ựánh giá thống kê có ý nghĩa cho việc bắt cặp các amino acid.
Phân ựoạn FIII-1
Lumbricus bimascus_AF433650..DSSAASTVRQTHDVDSIFVHEDYNGNTFENDVSVIKTVNAIAIDINVGPI..
Belgica antarctica_DQ507327..NGVDGGEVRHTVPSGNYRVHPNYNPSNLNNDIAVMINPFVGYTANIQPVL..
Eisenia fetida_AY840996 ..WQQSDTSGTQTANVDSYTMHENYGAGTASYSNDIAILHLATSISLGGNIQ..
Mus.musculus_ Q8BZ10 ..FGRTLSSPLTTRKVESIIVHENYASHKHDDDIAVVKLSSPVLFSENLHRV..
Lumbricus rubellus_P83298 ..WQQSDTSGTQTANVDSYTMHENYGAGTASYSNDIAILHLATSISLGGNIQ.. :*** **:*
DVDSIMVHEDY
Lumbricus bimascus_AF433650..GPICAPDPANDYVYRKSQCSGWGTINSGGVCCPNVLRYVTLNVTTNAFCD..
Belgica antarctica_DQ507327..QPVLRASGGDQFAGVTATMSGWGGIVGGGTSEPLRAASNTVITNAACAAV..
Eisenia fetida_AY840996 .AAVLPANNNNDYAGTTCVISGWGRTDGTNNLPDILQKSSIPVITTAQCTA..
Mus.musculus_ Q8BZ10 ..RVCLPDATFQVLPKSKVFVTGWGALKANGPFPNSLQEVEIEIISNDVCNQ..
Lumbricus rubellus_P83298 .AAVLPANNNNDYAGTTCVISGWGRTDGTNNLPDILQKSSIPVITTAQCTA.. **.* :.* ** :*****
LPVNTELKFVGVTCTLSGWGR
Hình 3.19: So sánh trình tự amino acid FIII-1 trùn quế với Lumbrokinase của trùn ựất Lumbricus rubellus
(P83298), Eisenia fetida ( AY840996), Lumbricus bimastus (AF433650), tiền chất Serine protease
Mus.musculus (Q8BZ10), Serine protease của Belgica antarctica (DQ507327).
Phân ựoạn FIII-2
Mus.musculus_P69525 . .IVGGVEAAPGEFPWQVSLRENHEHFCG---ATIIGARWLVSAAHCFNEFQDPA..
Eisenia fetida_AY438624.. .IIGGTDASPGEFPWQLSQTRGGSHSCG---ASLLNALNGLSAGHCVDGALPGT..
Eisenia fetida_EU167737 . .VIGGTDAAPGEFPWQLSQTRGGSHSCG---ASLLSSNSGLSASCVDGALPGSI..
Lumbricus rubellus_U25647..VIGGTNASPGEFPWQLSQQRQSGSWSHSCGASLLSSTSALSASHCVDGVLPNN..
Lumbricus rubellus_P83298 .VIGGTNASPGEFPWQLSQQRQSGSWSHSCGASLLSSTSALSASHCVDGVLPNN.. ::** :*****.** **
FIII-2 ILGGVEASPGEMP FPWNLS
Mus.musculus_P69525 ...ATIIGARWLVSAAHCFNEFQDPAQWAAQAGSVHLSGSEASAVRTRVLRIA..
Eisenia fetida_AY438624 ..ASLLNALNGLSAGHCVDGALPGTITVIAGLHDRSGTPGSQEVDITGYTVH..
Eisenia fetida_EU167737ẦẦẦ.. ASLLSSNSGLSASHCVDGALPGSITVIAGLHDRSGTPGSQVDITGYTMH-..
Lumbricus rubellus_U25647 ..ASLLSSTSALSASHCVDGVLPNNIRVIAGLWQQSETSGTQTANVDSYTMH..
Lumbricus rubellus_P83298 ..ASLLSSTSALSASHCVDGVLPNNIRVIAGLWQQSDTSGTQTANVDSYTMH.. * * **:**.:* : * ****
SNNANSAAHCVNGAIVSKIKVIAG
Hình 3.20: So sánh trình tự amino acid FIII-2 trùn quế với Lumbrokinase của Lumbricus rubellus (P83298),
Eisenia fetida (EU167737), serine protease Mus.musculus (P69525), tiền chất Lumbrokinase của Lumbricus
rubellus (U25647) và Eisenia fetida (AY438624).
(*) Các amino acid hoàn toàn giống nhau ; (. ) Các amino acid có cấu trúc 3D tương tự nhau, có thể thay thế cho nhau mà không ảnh hưởng ựến cấu trúc và chức năng của protein
Kết quả cho ở hình 3.19 và 3.20 cho thấy FIII-1 và FIII-2 có sự tương ựồng cao với protease thủy phân fibrin Lumbrokinase (EC 3.4.21) từ các loài trùn ựất Lumbricus
rubellusvàEisenia fetida. Trong ựó, FIII-2 có mức ựộ tương ựồng với FII Lumbrokinase
của Lumbricus rubellusvới tỷ lệ khá cao và có giá trị ựáng tin cậy. FII của lumbrokinase
có khối lượng phân tử là 26kDa với 242 amino acid, khả năng tương ựồng với ựoạn peptide khảo sát của FIII-2 ựạt 16,9% tống số amino acid ựược so sánh có mức ựộ cao hơn so với FIII-1(13,2%).
Các kết quả trên cho thấy các ựoạn peptide phân tắch ựược ựều có mối liên quan với các loài trùn ựất khác và dựa trên trình tự amino acid ựã biết có thể thiết kế các ựoạn mồi ựể sử dụng trong kỹ thuật PCR phân lập gen mã hóa cho các protease này ở giai ựoạn nghiên cứu tiếp theo.
Ngoài ra FIII-1 và FIII-2 cũng có trình tự amino acid tương ựồng với các enzyme thuộc nhóm serine protease của một số loài khác, mặc dù mức ý nghĩa tin cậy không cao nhưng cũng khẳng ựịnh thêm rằng các phân ựoạn enzyme ựã tinh sạch ựều liên quan ựến nhóm serine protease như ựã chứng minh trong phần khảo sát tắnh chất (3.4.1 và 3.4.2)
Vì ựây là kỹ thuật phân tắch mới, ựiều kiện không thể thực hiện trực tiếp ựược nhưng chúng tôi có thể ghi nhận ựược những lý do ựưa ựến kết quả chưa ựược như mong muốn như sau:
+ Quá trình xử lý mẫu mặc dù có thực hiện giai ựoạn khử cầu disulfide và alkyl hóa nhóm SH ựể tắnh tóan khối lượng peptide chắnh xác nhưng vẫn không thể so sánh ựược nhiều ựoạn peptide trên website ựể ựạt ựến mức ựộ có ý nghĩa theo quy luật.
+ Lượng protein quá thấp trên gel ựiện di hai chiều, lại qua nhiều giai ựoạn xử lý mẫu như thủy phân, loại muối và cô ựặc mẫu nên mẫu thu ựược ắt, vì vậy phổ peptite nhận ựược không có ựộ phân giải tốt (FI-a, FI-b, FII, FIII-3b, FIV)
+ Phân ựoạn FIII-3b còn lẫn tạp chất của keratin trong qúa trình xử lý mẫu vì thế phân ựoạn này cho kết quả không ựủ tin cậy.
Qua các kết quả nghiên cứu cơ bản trên hệ protease trùn quế tự phân chúng tôi nhận ựịnh có thể mở ra hai hướng ứng dụng về hệ enzyme này:
Hướng thứ nhất: trong y dược có khả năng sử dụng làm thuốc ựể thủy phân các cục máu nghẽn sau khi nghiên cứu thêm phần ựộc tắnh cấp và ựộc tắnh bán trường diễn trên ựối tượng ựộng vật trước khi sử dụng cho người.
Hướng thứ hai: trong nuôi trồng thủy sản tiến hành tự phân trùn quế nhằm tạo ra nguồn bột ựạm có chứa hàm lượng ựạm amine cao ựể sử dụng cho các ựối tượng ấu trùng có hệ tiêu hóa chưa hoàn chỉnh. Trong phạm vi ựề tài chúng tôi ựã nghiên cứu ứng dụng sản xuất bột ựạm cao cấp dùng nuôi ấu trùng tôm sú là ựối tượng hiện ựang ựược ngành thủy sản quan tâm ựồng thời giải quyết ựầu ra cho trùn quế ựang ựược nuôi một cách rộng rãi và ựại trà như hiện nay.
3.3. Khảo sát các ựiều kiện tối ưu ựể thu nhận bột trùn quế tự phân
Thông thường các yếu tố pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ enzyme và cơ chất, lượng nước bổ sung, thời gian thủy phân ảnh hưởng ựến tốc ựộ phản ứng enzyme nên cũng tác ựộng ựến quá trình tự phân giải trùn quế. Vì vậy, thắ nghiệm ựặt ra nhằm xác ựịnh các ựiều kiện thắch hợp ựể quá trình tự phân giải ựạt hiệu suất thủy phân cao nhất ựồng thời tìm chế ựộ sấy dịch tự phân phù hợp tạo bột ựạm ựạt chất lượng tốt.