khác nhau
Dựa trên bảng tổng kết các bước tinh sạch (bảng 3.4) ựể tắnh tóan tỷ lệ thu mẫu sau khi qua ba giai ựoạn chạy sắc ký. Kết quả bảng 3.5 cho thấy có sự khác biệt khá nhiều giữa các phân ựoạn tinh sạch, cao nhất là phân ựoạn FIII-1 chiếm 31,2% trên tổng số protein cả 6 phân ựoạn thu hồi sau giai ựoạn sắc ký lọc gel và thấp nhất là phân ựoạn FIII-3 chiếm 3,5% mặc dù vậy phân ựoạn này có hoạt tắnh trên ựĩa fibrin ựạt cao nhất so với sáu phân ựoạn tinh sạch.
Các phân ựoạn enzyme tinh sạch ựược pha trong ựệm 50 mM phosphate pH 7,5 tiến hành ựo hoạt tắnh trên cơ chất casein và ựĩa fibrin (theo mục 2.2.2). Mức ựộ thủy phân cơ chất casein không khác biệt nhiều giữa sáu phân ựoạn protease ựược tìm thấy, riêng về khả năng thủy phân fibrin trên ựĩa chỉ có phân ựoạn FII có hoạt tắnh thấp nhất gần như không ựặc hiệu ựối với cơ chất này.
Bảng 3.5. Xác ựịnh hoạt ựộ các phân ựoạn protease trên các cơ chất khác nhau
Phân ựoạn
Tỷ lệ thu mẫu(%)
Hoạt ựộ riêng trên ựĩa fibrin (plasmin
U/mg protein) Hoạt ựộ riêng trên casein (U/mg protein) Hoạt ựộ riêng trên BApNA (U/mg protein) Hoạt ựộ riêng trên BTpNA (U/mg protein) FI 7,6 602,1 1,81 0 0 FII 15,8 44,1 1,05 0 0 FIII-1 31,2 393,4 1,04 0,11 0 FIII-2 18,0 783,4 0,98 0,40 0 FIII-3 3,5 830,7 1,23 0 0 FIV 23,9 296,4 0,87 2,24 0
Hoạt tắnh thủy phân trên casein của các phân ựoạn enzyme trùn quế ựược thực hiện ở nhiệt ựộ 30oC nằm trong dãy 0,87-1,81 U/mg protein theo thứ tự F1> FIII-3> FII> FIII- 1> FIII-2> FIV.
Kết quả khảo sát hoạt tắnh enzyme trên ựĩa fibrin cho thấy sau 8 giờ ủ ở 37oC, cả 6 phân ựoạn ựều tạo thành những vòng tròn trong suốt do fibrin bị thủy phân. Dựa vào diện tắch vòng tròn thủy phân, có thể thấy khả năng thủy phân fibrin của phân ựoạn FII là thấp nhất, không ựặc hiệu ựối với cơ chất này. Hoạt ựộ riêng cao nhất thể hiện ở phân ựoạn FIII-3. Hoạt ựộ riêng trên ựĩa fibrin các phân ựoạn trong khoảng 44,1-830,7 ựơn vị plasmin/mg ựược tắnh dựa vào ựường chuẩn
plasmin, mức ựộ hoạt tắnh ựược xếp theo thứ tự sau: FIII-3> FIII-2> FI> FIII-1> FIV> FII. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Cho và ctv. (2004a) trên trùn
Lumbricus rubellus, mức ựộ thủy phân cơ chất casein không khác biệt nhiều giữa sáu
phân ựoạn protease ựược tìm thấy, riêng về khả năng thủy phân trên ựĩa fibrin chỉ có phân ựoạn F6 có hoạt ựộ cao nhất [56]. Như vậy, với khả năng này hệ protease trùn quế có thể ứng dụng ựược trong ựiều trị các bệnh về tim mạch, làm tan các cục máu ựông khi ựược thu nhận với lựợng lớn và ựược thử trên lâm sàng ựể ựạt các tiêu chuẩn trong y dược học.
Nhằm phân loại nhóm protease các phân ựoạn enzyme sau tinh sạch ựược khảo sát trên các cơ chất tổng hợp kết hợp với các chất ức chế ựặc hiệu (mục 3.2.2.2). Kết quả hoạt tắnh trên cơ chất tổng hợp BApNA ựặc hiệu cho nhóm protease trypsin cho thấy 3 phân ựoạn FIII-1, FIII-2 và FIV có khả năng thủy phân liên kết peptid chứa nhóm carboxyl của arginine trên cơ chất BApNA. Riêng hoạt ựộ riêng với cơ chất này ựạt cao nhất ở phân ựoạn FIV, kết hợp với kết quả bị ức chế hoàn toàn bởi SBTI (bảng 3.5) nên có thể phân loại FIV này thuộc nhóm giống trypsin. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của
Hình 3.13 : Hoạt tắnh thủy phân trên ựĩa fibrin các phân ựoạn enzyme tinh sạch
Mihara và ctv.(1991) trên loài trùn Lumbricus rubellus Nhật Bản có các phân ựoạn FIII có hoạt tắnh enzyme giống trypsin [81]. Cả sáu phân ựoạn enzyme ựều không tác ựộng lên cơ chât BTpNA nên chúng không thể là nhóm enzyme giống chymotrypsin, ựiều này cũng ựược khẳng ựịnh lại trên chất TPCK ức chế ựặc hiệu cho chymotrypsin.
3.2.3.2 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tắnh protease
Sáu phân ựoạn protein tinh sạch ựược hòa tan trong ựệm 50 mM phosphate và ủ trong 10 phút ở 37oC với 8 chất ức chế ở bảng 3.6. Kết quả cho thấy ựối với chất ức chế TPCK ựặc hiệu kìm hãm nhóm serine protease chymotrypsin gần như không bị ức chế, kết quả này phù hợp với kết quả thử trên cơ chất ựặc hiệu BTpNA ở bảng 3.5. Pepstatin ựặc hiệu kìm hãm nhóm aspartic protease cũng gần như không bị ức chế. Khả năng ức chế của 1mM PMSF cho thấy hầu hết cả sáu phân ựoạn ựều bị mất hoạt tắnh ở các mức ựộ khác nhau, FI; FII và FIII-3 gần như bị mất hoạt tắnh hoàn toàn, FIII-1; FIII-2 và FIV bị mất hoạt tắnh từ 92-98%. Tất cả ựiều này cho phép dự ựoán cả sáu phân ựoạn protease tinh sạch ựược từ trùn quế thuộc nhóm serine protease, không thuộc nhóm mang ion kim loại vì tất cả chúng ựều không bị kìm hãm bởi EDTA.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tắnh các phân ựoạn enzyme trùn quế sau tinh sạch
Hoạt tắnh tương quan (%)
Chất ức chế Nđ (mM)
FI FII FIII-1 FIII-2 FIII-3 FIV
đối chứng 100 100 100 100 100 100 PMSF 1 0 0 2 4 0 8,4 TPCK 0,1 100 100 96,3 100 76 100 Aprotinin 0,01 29,3 95,2 86,7 95,2 25,5 71 Leupeptin 0,1 0 100 97,6 100 0 73 SBTI 0,01 0 76,1 80,6 92,8 0 0 EDTA 1 100 100 100 100 100 100 Chymostatin 0,1 19,1 100 75,5 100 18,5 89,8 Pepstatin 1 100 57,9 60,1 85,6 82,7 74,6
Phân ựoạn FIII-1 và FIII-2 có khả năng thủy phân ựược cơ chất tổng hợp BApNAnhưng lại bị ức chế bởi SBTI khoảng 17-20%, các phân ựoạn FI, FIII-3 gần như bị mất hoạt tắnh hoàn toàn bởi aprotinin, SBTI, leupeptin, chymostatin nhưng ựiều này cũng chỉ khẳng ựịnh thêm rằng tất cả các phân ựoạn tinh sạch trừ phân ựoạn FIV thuộc nhóm serine protease giống trypsin còn lại là không thuộc nhóm giống trypsin hoặc chymotrypsin vì hoàn toàn chúng có tác dụng rất ắt hoặc không có tác dụng trên cả hai cơ chất tổng hợp BApNA và BTpNA.