Cấu trúc phân tử fibrinogen

Một phần của tài liệu Nghiên cứu hệ protease trùn quế (perionyx excavatus) trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng (Trang 31)

Phần phụ phân cực Aα Vòng disulfide

Cụm carbohydrate Thùy γ

disulfide. Việc ựịnh hướng các gốc amino acid trong cấu trúc phân tử fibrinogen luôn luôn là: bên trong cuộn xoắn chứa các gốc kỵ nước và bên ngoài là các gốc phân cực Các domain nhánh có khối lượng phân tử 67.200Da, hầu hết cấu trúc chủ yếu trong các domain này ựược hiển thị bằng các nếp gấp ngẫu nhiên của các mạch γ và β tương ứng ựược gọi là thùy (lobe) γ và β. Ngoài ra, các domain nhánh còn có bốn cụm carbohydrate, mỗi cụm khoảng 2.500Da, hai cụm ựịnh vị trên mạch β ở mỗi domain nhánh và hai cụm nằm trên mạch γ ở mỗi nhánh gần domain trung tâm. Phần phụ phân cực Aα là vị trắ ựể tạo các liên kết chéo trong phân tử fibrin và chúng nằm gần ựầu cuối carboxyl của mạch γ.

b. Sự polymer hóa fibrinogen tạo fibrin

Sự polymer hóa fibrinogen ựược thực hiện khi có mặt của thrombin. Thrombin có nhiệm vụ tạo thành sợi fibrin không hòa tan từ fibrinogen. đầu tiên là thành lập các monomer fibrin, bằng việc cắt hai ựoạn peptide A và B từ ựầu cuối amin của mạch Aα và Bβ bởi thrombin [65], [66]. Việc loại bỏ ựoạn peptide của fibrinogen dẫn ựến sự polymer hóa tự phát các monomer fibrin thành fibrin, vì

khi loại bỏ peptide A lộ ra một ựiểm polymer hóa ựầu amin của mạch α với trình tự của Gly-Pro-Arg. Vị trắ này sẽ tương tác với một vị trắ tương thắch trên thùy γ của domain nhánh. Trên hai cạnh ựối nhau của phân tử, peptide B cũng lộ ra ựầu amine của của mạch β với trình tự của Gly-His-Arg, vị trắ này sẽ tương tác với một vị trắ bổ sung thùy β của domain nhánh. Phản ứng khởi ựầu này tạo một dimer, từ ựó có thể kết hợp với các monomer fibrin khác tạo thành một protofibril.

Hình 1.6: Tiến trình polymer hóa fibrinogen tạo fibrin

Fibrinogen

Monomer

Dimer

Protofibril

Các liên kết chéo của protofibril bắt ựầu chuyển hóa yếu tố cảm ứng thrombin (yếu tố XIII) tạo thành enzyme transglutaminase gọi là yếu tố XIIIa có khả năng liên kết các mạch bên của lysine và glutamine bằng các liên kết peptide giữa các mạch protofibril, khoảng 6 liên kết có thể gắn kết các monomer fibrin kề nhau. Ban ựầu liên kết chéo nhanh chóng cuộn các mạch γ thành hai phân tử fibrin thẳng hàng theo kiểu ựối dịên và song song với nhau (hình 1.6). Sau ựó, là các mạch α liên kết lại tạo nên một kiểu liên kết chéo phức tạp tương ứng với sự tạo thành các sợi fibrin dày có ựộ ựàn hồi lớn và bị phân giải bởi plasmin.

c. Sự phân giải fibrinogen và fibrin

Trong cơ thể, sự thủy phân sợi fibrin không chỉ cần thiết trong việc làm lành vết thương mà còn giới hạn khả năng lan rộng sự vón cục máu. Giữ vai trò quan trọng trong chức năng cầm máu là sự hoạt hóa plasminogen thành plasmin và sự tương tác của chúng với fibrinogen và fibrin. Plasminogen tồn tại dưới hai dạng là Glu-plasminogen và Lys- plasminogen. Dạng Glu-plasminogen khi

chưa bị phân cắt có ựầu amine chứa acid glutamic vì vậy ựược gọi là Glu- plasminogen. Khi có mặt của plasmin, Glu-plasminogen bị cắt ở vị trắ Lys76-Lys77 tạo thành Lys-plasminogen [110] và loại này có ái lực cao ựối với fibrin hơn Glu- plasminogen [53]. Cả hai dạng của plasminogen này có thể bị phân cắt ở liên kết peptide Arg560-Val561 bởi uPA (chất hoạt hóa plasminogen urokinase) hoặc tPA (chất hoạt hóa plasminogen của mô) tạo thành plasmin [101]. Cả hai dạng plasminogen ựều có hai vị trắ gắn với

monomer fibrin, một có ái lực cao và một Hình 1.7 : Mô hình phân giải fibrinogen bởi plasmin (Mander, 1982) Mảnh X Mảnh Y Mảnh E Mảnh D Fibrinogen

có ái lực thấp. Bằng việc tương tác với fibrin, phắa có ái lực thấp hoạt hóa plasminogen gấp 5 lần so với phắa có ái lực cao.

Fibrin và fibrinogen ựều bị phân giải bởi plasmin, là enzyme thuộc nhóm serine protease chuyên thủy phân liên kết peptide có mạch bên arginyl và lysyl trong cấu trúc cuộn xoắn. Tiến trình phân giải fibrinogen theo thứ tự ựược mô tả ở hình 1.7. Theo Mander sản phẩm trung gian là các mảnh X và Y. Mảnh X là kết quả từ việc loại bỏ phần phụ phân cực Aα khỏi fibrinogen, mảnh Y là kết qủa từ việc cắt cuộn xoắn giữa ựoạn của domain trung tâm và domain nhánh tạo ra mảnh D và Y. Việc cắt xa hơn nữa mảnh Y lại tiếp tục tạo ra mảnh D và E.

Những bước phân giải này cũng tương tự cho fibrin không có các liên kết chéo. Cũng có thể dự ựóan nếu có liên kết chéo thì sản phẩm của sự thủy phân fibrin sẽ có sự khác biệt. Khi có các liên kết chéo thì sự phân giải fibrin sẽ chậm lại và tạo các dẫn suất khác nhau rất phức tạp trong suốt quá trình hòa tan cục máu ựông.

1.2.3.2 Vai trò của enzyme thủy phân fibrin trong ựiều trị tim mạch

Như ựã ựề cập về hoạt ựộng của hệ thống fibrinogen và fibrin trong cơ chế cầm máu. Ở các mô bình thường, luôn có sự cân bằng ựộng giữa hai quá trình này. Trong hầu hết các bệnh về tim mạch như tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc ựộng mạch phổi người ta ựều thấy nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch là do các cục máu ựông lưu giữ trong mạch. Nhưng nếu quá trình thủy phân fibrin tăng bởi nguyên nhân bệnh lý sẽ dẫn ựến hậu quả chảy máu quá mức. Trong thực tế, việc xử lý bệnh nghẽn mạch ựều dựa vào việc sử dụng các chất kháng ựông hóa học như heparin và coumadin ựể kìm hãm sự tạo thành các cục máu fibrin. Các nghiên cứu lâm sàng ựã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất ựể ựiều trị chứng nghẽn mạch là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin, nói cách khác là các chất hoạt hóa plasminogen. Hiện nay các enzyme thường ựược sử dụng trong ựiều trị này là streptokinase (từ vi khuẩn

Streptococcus haemolyticus), urokinase (từ nước tiểu của người) và tPA tái tổ hợp. Việc sử dụng các enzyme này tương ựối hiệu quả, nhưng nó vẫn chưa thể giải quyết ựược hết các vấn ựề nảy sinh trong quá trình ựiều trị bệnh nghẽn mạch. Việc ựiều trị bằng

streptokinase có tác dụng phụ là gây sốt cho bệnh nhân, có xu hướng tăng chảy máu, tạo kháng nguyên và khó có thể xác ựịnh liều lượng thắch hợp [61]. tPA tái tổ hợp và urokinase tuy không có vấn ựề miễn dịch như ựối với streptokinase nhưng giá thành lại rất ựắt.

Do các tồn tại trên và nhu cầu chữa bệnh nghẽn mạch là rất lớn nên các nhà nghiên cứu ựã tìm kiếm những tác nhân tự nhiên có thể phân giải trực tiếp cục máu ựông gây nghẽn mạch, có tác dụng thủy phân fibrin như plasmin có trong cơ thể. Họ cho rằng enzyme thủy phân trực tiếp fibrin có thể khắc phục ựược những vấn ựề còn tồn tại ựối với các loại thuốc ựã sử dụng. Do ựó việc dò tìm các enzyme thủy phân trực tiếp fibrin làm thuốc chữa bệnh tim mạch ựã tỏ ra có nhiều triển vọng và ngày càng mở rộng trên nhiều ựối tượng khác nhau từ nước tiểu ở người, ựộng vật, thực vật cho ựến vi sinh vật.

1.2.3.3 Các nghiên cứu về enzyme thủy phân fibrin

Enzyme thủy phân fibrin có nguồn gốc từ ựộng vật: Loài trùn ựất Lumbricus rubellus

ựã ựược phát hiện tại Nhật [81], [82], có khả năng thủy phân mạnh fibrin và sau ựó ựược tinh sạch gồm 6 isozyme ựều có khả năng ựó và ựược ựặt tên là Lumbrokinase. Tiếp theo là các nghiên cứu trên lọai trùn này ở Hàn Quốc [46], [47] cũng ựã tinh sạch, khảo sát các ựặc ựiểm, giải trình tự nucleotide và nhân dòng gen mã hóa lumbrokinase có hoạt tắnh thủy phân fibrin cao. Năm 1997, Yang J.S ựã tách chiết enzyme thủy phân fibrin ựược hoạt hóa bởi SDS có nguồn gốc từ loài trùn ựất Eisenia fetida [112]. Bằng các kỹ thuật sắc ký trên gel DEAE sepharose, sephadex G-75 và phenyl sepharose ựã tinh sạch ựược loại enzyme có khối lượng phân tử 45kDa gồm hai tiểu ựơn vị, tiểu ựơn vị lớn 26kDa và tiểu ựơn vị nhỏ 18kDa gắn kết với nhau bằng các liên kết tương tác kỵ nước. Enzyme thủy phân fibrin ựược tách chiết từ sâu bướm Lonomia achelous ở Venezuela bởi Coll-Sangrona. E và ctv (1998) [52] có hoạt tắnh khoảng 100 ựơn vị urokinase/mL. Enzyme này có khả năng phân hủy các cục máu ựông với tốc ựộ chậm hơn so với sự thủy phân của plasmin. Các vị trắ cắt của enzyme này trên phân tử fibrinogen khác với các vị trắ cắt của plasmin.

Dametto và ctv, năm 2000 ựã tinh sạch ựược enzyme giống trypsin có khả năng thủy phân fibrin từ một giống ruồi Haematobia irrtans. Bằng cột sắc ký ái lực chuyên biệt

SBTI-sepharose ựã tách ựược enzyme có khối lượng phân tử 25,5 kDa hoạt ựộng ở pH tối ưu bằng 9 và thủy phân ựược cơ chất tổng hợp H-D Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide ựặc trưng cho enzyme giống trypsin và có thể thủy phân cả fibrinogen và fibrin với hoạt tắnh rất cao [93].

Enzyme thủy phân fỉbrin từ vi sinh vật: Năm 1987, Sumi sau nhiều năm nghiên cứu về enzyme phân giải cục máu nghẽn và tìm kiếm tác nhân tự nhiên có thể hòa tan cục nghẽn liên quan ựến nhồi máu cơ tim ựã phát hiện ra nattokinase cũng là một enzyme có khả năng thủy phân fibrin mạnh. Nattokinase ựược chiết tách và tinh sạch từ ựậu nành lên men có tên gọi Natto, là một lọai thực phẩm truyền thống của Nhật Bản. Quá trình lên men ựược bổ sung vi khuẩn Bacillus natto vào dịch ựậu nành ựã ựược nấu chắn và chắnh lọai vi khuẩn này sản sinh enzyme nattokinase [114].

Tiếp theo là hàng loạt các nghiên cứu trên ựối tượng vi sinh vật ở Hàn quốc, Kim W.K và ctv (1996) ựã tinh sạch enzyme thủy phân fibrin từ Bacillus sp CK 11-4 ựược chiết tách từ nước sốt ựậu nành lên men [75]. Một nghiên cứu khác của Kim H.K và ctv cũng tinh sạch và khảo sát các ựặc ựiểm thủy phân fibrin từ Bacillus sp KA38 có nguồn gốc từ cá muối lên men [73]. Douchi là loại thực phẩm lên men từ ựậu nành Trung Quốc cũng ựược Wang và ctv (2006) ựã chiết tách và xác ựịnh các tắnh chất một enzyme thủy phân mạnh fibrin và fibrinogen từ chủng Bacillus subtilis DC33 có khối lượng phân tử khoảng 30kDa, với hoạt tắnh 418 IU cho mỗi ml môi trường nuôi cấy LB [117].

Một enzyme thủy phân fibrin có tắnh chất giống chymotrypsin thuộc nhóm protease kim loại, bị kìm hãm bởi EDTA và EGTA cũng ựược phát hiện bởi Park và ctv năm 2007, tinh sạch từ môi trường lên men nấm Flammulina velutipes [90].

Enzyme thủy phân fibrin có nguồn gốc từ thực vật: Việc nghiên cứu các enzyme có hoạt tắnh thủy phân fibrin cao không chỉ dừng lại ở các ựối tượng ựộng vật và vi sinh vật mà còn khai thác cả trên thực vật. Choi và Sa (2001) ựã tách chiết và khảo sát ựặc tắnh của enzyme thủy phân fibrin từ loài bèo tấm Spirodela polyzhira là loại enzyme có hai sợi polypeptide với khối lượng phân tử 145kDa và 70kDa. Với khả năng thủy phân ựược không những cơ chất fibrinogen, fibrin mà còn có hoạt tắnh kháng thrombin. Vì vậy có thể sử dụng trong ựiều trị lâm sàng ựối với bệnh nghẽn mạch [53]. Kim J.S và ctv (2006)

ựã tinh sạch enzyme protease trung tắnh từ loại nấm ăn chữa bệnh Cordyceps militaris

(Hàn Quốc) với khối lượng phân tử 52 kDa có khả năng thủy phân nhanh mạch α, mạch γ-γ của fibrin và thủy phân mạch β fibrin nhưng chậm hơn [14].

Như vậy với vai trò quan trọng của nhóm enzyme thủy phân fibrin trong ựiều trị bệnh tim mạch nên việc tinh sạch và khảo sát các ựặc tắnh hóa học của nó trên các ựối tượng khác nhau là ựiều cần thiết. Qua ựó ựã chứng minh ựược việc sử dụng các loài trùn ựất trong các bài thuốc dân tộc ở phương đông nói chung và Việt Nam nói riêng ựể ngăn ngừa và ựiều trị bệnh tim mạch là hoàn toàn có cơ sở khoa học.

1.2.4 Ứng dụng protease trong quá trình tự phân protein

1.2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng ựến qúa trình tự phân

Quá trình tự phân của trùn quế thực chất là quá trình thủy phân protein trùn quế dưới tác ựộng của hệ enzyme protease nội sinh. Vì vậy các yếu tố ảnh hưởng ựến quá trình tự phân cũng chắnh là các yếu tố ảnh hưởng ựến phản ứng có enzyme xúc tác. Thông thường các yếu tố này bao gồm pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ enzyme và cơ chất, lượng nước bổ sung, thời gian thủy phân và diện tắch tiếp xúc.

Ảnh hưởng của pHlên quá trình tự phân

pH ảnh hưởng rất lớn ựến hoạt tắnh enzyme do liên quan ựến sự tương tác giữa enzyme và cơ chất. Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào ựiện tắch phân bố trên cả enzyme lẫn cơ chất, cụ thể là trung tâm hoạt ựộng của phân tử enzyme. Mỗi enzyme chỉ hoạt ựộng mạnh nhất ở một pH xác ựịnh, gọi là pH tối ưu. pH tối ưu cho hoạt ựộng của nhiều enzyme vào khoảng 7. pH quá cao hay quá thấp có thể làm enzyme bị biến tắnh. pH tối ưu của mỗi enzyme có thể thay ựổi trong một khoảng nhất ựịnh tùy theo tắnh chất và nồng ựộ cơ chất, nhiệt ựộ và bản chất của các loại dung dịch ựệm [4].

Ảnh hưởng của nhiệt ựộ lên quá trình tự phân

Bản chất của enzyme là protein do ựó nhiệt ựộ có ảnh hưởng rất lớn ựến vận tốc phản ứng. Nhiệt ựộ tăng tốc ựộ phản ứng tăng nhưng ựến mức nào ựó thì tốc ựộ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tắnh. đa số enzyme có nhiệt ựộ tối ưu khoảng 40 - 50ồC. Ở nhiệt ựộ trên 70oC phần lớn các enzyme ựều mất hoạt tắnh. Nhiệt ựộ tối ưu của các enzyme khác nhau thì không giống nhau, chúng tùy thuộc vào nguồn gốc sản sinh ra

chúng. Phần lớn nhiệt ựộ tối ưu của enzyme từ vi sinh vật, thực vật cao hơn ựộng vật [24]. Nhiệt ựộ tối ưu của mỗi enzyme không cố ựịnh mà thay ựổi theo thời gian thủy phân, nồng ựộ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng tồn tại của enzyme [4].

Ảnh hưởng của nồng ựộ enzyme và cơ chất trong quá trình tự phân

Trong trường hợp cơ chất ựầy ựủ, nồng ựộ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc ựộ phản ứng [18]. Nhưng nếu tăng nồng ựộ enzyme cao quá sẽ không có hiệu quả kinh tế, ngược lại nếu cơ chất quá nhiều sẽ ảnh hưởng ựến tốc ựộ phản ứng enzyme. Vì vậy cần nghiên cứu chọn nồng ựộ enzyme phù hợp với lượng cơ chất nhất ựịnh. Trong quá trình tự phân ựôi lúc sản phẩm sinh ra cũng có thể ức chế hoạt ựộng của enzyme, làm cho phản ứng xảy ra chậm và ảnh hưởng ựến chất lượng sản phẩm [109].

Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung trong quá trình tự phân

Trong phản ứng thủy phân protein bằng enzyme, nước không những là môi trường ựể khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia phản ứng. Lượng nước cho vào nếu ắt quá thì tác dụng thủy phân của enzyme kém nhưng nếu nhiều quá thì sẽ tạo ựiều kiện thuận lợi cho vi sinh vật hoạt ựộng làm ảnh hưởng ựến chất lượng của dịch ựạm thủy phân. đối với quá trình tự phân trùn quế ựể sản xuất bột ựạm amine thì lượng nước bổ sung ngoài ảnh hưởng ựến việc tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất còn ảnh hưởng ựến quá trình sấy khô sản phẩm, vì vậy cần nghiên cứu ựể chọn ựược tỷ lệ nước bổ sung thắch hợp là cần thiết.

Ảnh hưởng của thời gian tự phân

Theo một số nghiên cứu thì mức ựộ thủy phân tăng vọt trong thời gian ựầu của phản ứng, sau ựó tốc ựộ phản ứng chậm lại. Thời gian thủy phân dài hơn, cần sử dụng lượng enzyme lớn hơn thì mức ựộ thủy phân mới có thể cao hơn. Thời gian thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kắch thước nguyên liệu, cấu trúc, loại protein Ầ

Ảnh hưởng của diện tắch tiếp xúc

Diện tắch tiếp xúc cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng ựến quá trình thủy phân. để tạo ựiều kiện tốt hơn cho quá trình thủy phân cần tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và

Một phần của tài liệu Nghiên cứu hệ protease trùn quế (perionyx excavatus) trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng (Trang 31)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(189 trang)