Xác ựịnh cơ chất và chất ức chế ựặc hiệu nhằm có thể phân loại nhóm protease, khảo sát các ựiều kiện nhiệt ựộ và pH tối ưu, pI và ựộ bền theo thời gian của từng loại protease tinh sạch ựược.
Khảo sát hoạt tắnh thủy phân các phân ựoạn protein sau khi tinh sạch trên các cơ chất khác nhau
+ Hoạt tắnh thủy phân protease trên cơ chất casein và ựĩa fibrin ựã trình bày ở phần 2.2.1.1.
+ Hoạt tắnh thủy phân trên cơ chất tổng hợp Nα-benzoyl-arginine p-nitroanilide; Nα- benzoyl-tyrosine p-nitroanilide [108]. Mỗi cơ chất ựược pha trong 50mM Tris-HCl, pH 7,4 có nồng ựộ 0,2mM phản ứng với 10ộl enzyme. Sau khi ủ ở 37oC trong 10 phút, phản ứng kết thúc bằng cách thêm 2ml acetic acid 50% và sản phẩm p-nitroaniline giải phóng ựựơc ựo ở ựộ hấp thu 490nm. Một ựơn vị hoạt tắnh enzyme ựược xác ựịnh là lượng enzyme cần thiết ựể giải phóng 1ộmol p-nitroaniline trong một phút dưới các ựiều kiện trên và biểu hiện qua ựơn vị U/mg protein.
Ảnh hưởng chất ức chế lên hoạt tắnh protease
Các phân ựoạn enzyme tinh sạch ựược pha trong ựệm 50 mM phosphate pH 7,5 xác ựịnh hàm lượng protein và ủ trong 10 phút ở 37oC với 8 chất ức chế : phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF), N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl keton (TPCK), aprotinin, leupeptin, soybean trypsin inhibitor (SBTI), ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA), chymostatin, peptastatin với nồng ựộ gốc từ 0,01-1 mM, sau ựó xác ựịnh hoạt tắnh protease theo phương pháp Anson cải tiến. Hoạt tắnh tương quan ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme hoạt ựộng ở mẫu enzyme không có chất ức chế.
Xác ựịnh nhiệt ựộ tối ưu và ựộ bền nhiệt của các protease
+ Xác ựịnh nhiệt ựộ tối ưu: Các phân ựoạn enzyme tinh sạch ựược hòa tan trong ựệm 50 mM phosphate pH 7,5, xác ựịnh hàm lượng protein và ủ ở các nhiệt ựộ khác nhau 30,
37, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 và 80ồC trong 10 phút. Xác ựịnh hoạt tắnh protease tại các nhiệt ựộ trên. Hoạt tắnh tương quan trong thắ nghiệm ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme ở nhiệt ựộ tối ưu.
+ Xác ựịnh ựộ bền nhiệt của các protease: Các phân ựoạn enzyme tinh sạch xác ựịnh hàm lượng protein, ựược ủ ở các nhiệt ựộ 37, 50, 55, 60, 65, 70oC trong 3 giờ. Sau ựó ổn ựịnh ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút, ựo hoạt tắnh bằng phương pháp Anson cải tiến. Hoạt tắnh tương quan % trong thắ nghiệm ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme hoạt ựộng ở 37oC.
Xác ựịnh pH tối ưu và ựộ bền pH của các protease
+ Xác ựịnh pH tối ưu : pH tối ưu của các phân ựoạn protease sau khi tinh sạch ựược khảo sát ở các giá trị pH khác nhau từ 2-13. Enzyme ựược ủ ở các pH trong 30 phút và ựo hoạt tắnh protease ở các pH trên. Hoạt tắnh tương quan ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme ở pH tối ưu.
+ Xác ựịnh ựộ bền pH : Các phân ựoạn enzyme ựược ủ ở pH từ 2-13 trong 16 giờ ở 4ồC. Sau ựó dung dịch enzyme ựược ựưa về pH 7, xác ựịnh hoạt tắnh bằng phương pháp Anson cải tiến. Hoạt tắnh tương quan trong thắ nghiệm ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme hoạt ựộng ở pH 7.
Xác ựịnh ựộ bền enzyme theo thời gian
Các phân ựoạn enzyme ựược pha trong hai dung môi nước và ựệm 50mM phosphate pH 7,5 chứa NaN3 0,1% với nồng ựộ 1mg/ml, hàn kắn miệng ựể tránh sự bay hơi dung môi, bảo quản ở 4oC.
Kiểm tra hoạt tắnh enzyme còn lại một lần mỗi tháng trong thời gian 10 tháng. Hoạt tắnh tương quan ựược so sánh với hoạt tắnh tại thời ựiểm ựầu tiên của từng phân ựoạn.
Kiểm tra hoạt tắnh thủy phân fibrinogen bằng kỹ thuật SDS-PAGE [111]:
Hỗn hợp 10 ộl dung dịch các phân ựoạn enzyme tinh sạch (1mg/ml) và 450ộl bovine fibrinogen (1mg/ml) ựược ủ ở 37ồC. Dịch thủy phân ựược lấy ở các thời ựiểm 10, 20,
30, 60, 90, 120, 180, 240 và 480 phút. Sau ựó ngừng phản ứng, ựem ựun ở 100ồC. Sau ựó mỗi mẫu lấy 20ộg protein ựem chạy ựiện di SDS với gel polyacrylamide 12%.
Xác ựịnh ựiểm ựẳng ựiện các protease sau tinh sạch bằng ựiện di hai chiều
- Quy trình xử lý mẫu enzyme sau khi tinh sạch theo kắt 2D-Cleanup Kit (Bio-Rad)
(xem phụ lục 1.6.1)
- điện di chiều thứ nhất IEF (Isoelectric Focusing)
+ Sử dụng các thanh ựiện di IPG (IPG Strip, Bio-Rad) có gradient pH từ 3-10. + Kỹ thuật ựiện di (xem phụ lục 1.6.2)
- điện di chiều thứ hai SDS-PAGE
+ đổ gel phân tắch polyacrylamide 12% ựể chạy chiều thứ hai và không cần gel tập trung (xem phụ lục 1.6.2)
+ Lượng mẫu ựưa vào khoảng 10ộg protein
Phân tắch các protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật MALDI-TOF-TOF
Việc phân tắch này ựể so sánh trình tự amino acid các ựoạn peptide ựược tách ra sau quá trình thủy phân các protease tinh sạch từ trùn quế bởi trypsin với trình tự các amino acid ựã công bố trên ngân hàng dữ liệu trình tự protein không giới hạn NRDBnhằm ựánh gắa sự tương ựồng với những protease từ các loài trùn ựất và một số loài khác.
Các mẫu enzyme FI-a, FI-b, FII, FIII-1, FIII-2, FIV sau khi chạy ựiện di hai chiều cắt ựiểm protein trên gel. Riêng FIII-3 do sự tự phân quá mạnh mặc dù có xử lý chất ức chế nhưng vẫn không thể chạy ựiện di hai chiều nên chúng tôi cắt phân ựoạn này ở 2 ựiểm trên gel ựiện di một chiều. Tiến hành xử lý mẫu, thủy phân bằng trypsin và làm khô ựược tiến hành tại Phòng thắ nghiệm Enzyme (đại Học Cần Thơ) theo protocol của trung tâm protein và proteomic đại Học Singapor. (phụ lục 1.7.1). Sau ựó mẫu trữ lạnh - 20oC. Mẫu tiếp tục phân tắch bằng kỹ thuật khối phổ MALDI-TOF-TOF
Các peptide sau khi thủy phân ựược phân tắch tại trung tâm proteomic đại Học Quốc gia Singapor
Tủa protein Trùn quế ( Perionyx excavatus) Tự thủy phân Khảo sát sơ bộ (pH, nhiệt ựộ, chất ức chế protease)
Sắc ký trao ựổi ion âm trên gel Unosphere Q
Tương tác kỵ nước trên gel Phenyl Sepharose
Lọc gel Superose 12
SDS-PAGE
Khảo sát ựặc ựiểm các protease sau tinh sạch
Thử hoạt tắnh các cơ chất khác nhau
Ảnh hưởng chất ức chế,
pH, To, ựộ bền enzyme 2-D ựiện di, phân tắch thành phần peptide
2.2.3 Khảo sát các ựiều kiện tối ưu ựể thu nhận bột trùn quế tự phân
Xác ựịnh các ựiều kiện thắch hợp ựể quá trình tự phân ựạt hiệu suất cao nhất và tìm chế ựộ sấy thắch hợp cho sản phẩm tự phân trùn quế.