B. độ bền pH các phân ựoạn enzyme sau khi tinh sạch
3.36 Biểu ựồ chiều dài của hậu ấu trùng tôm sú ở các giai ựoạn phát triển
Kết quả thắ nghiệm cho thấy ngay từ giai ựoạn Postlarvae-5 ở nghiệm thức tôm cho ăn thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân có sự tăng trưởng về chiều dài tốt hơn so với nghiệm thức ựối chứng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế chưa thủy phân. Từ giai ựoạn Postlarvae-10 trở ựi ở nghiệm thức sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân cho kết quả tăng trưởng chiều dài cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với 2 nghiệm thức còn lại. Chiều dài trung bình của tôm Postlarvae-15 cao nhất ở nghiệm thức sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân (12,63 mm) và thấp nhất ở nghiệm thức sử dụng thức ăn Frippak (11,58 mm).
Thạch Thanh và ctv (2005) khi ương ấu trùng tôm sú trong môi trường nước biển nhân tạo cho kết quả tăng trưởng chiều dài Postlarvae-5 và Postlarvae-10 lần lượt là 8,52 và 10,42 mm [29]. Theo Kungvankij (1986) trắch trong Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải (2004), Postlarvae-15 có chiều dài 12 mm [23]. Như vậy, có thể thấy kết quả thắ nghiệm phù hợp với các công bố trước ựây và ở nghiệm thức sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân cho kết quả tăng trưởng chiều dài tốt nhất chứng tỏ nguồn
thức ăn giàu ựạm amine từ sản phẩm tự phân của trùn quế ựã ựược ấu trùng tôm hấp thu tốt.
Chất lượng hậu ấu trùng
Kết quả sốc ấu trùng tôm bằng formol 150 ppm trong 30 phút ựược thể hiện qua bảng 3.18 và biểu ựồ hình 3.37:
Bảng 3.18: Tỷ lệ sống (%) của hậu ấu trùng khi sốc formol
Nghiệm thức Tỷ lệ sống của hậu ấu
trùng khi sốc formol (%)
NT1: TACB từ bột trùn quế tự phân + Artemia 98,67 ổ 1,15a NT2: TACB từ bột trùn quế chưa thủy phân + Artemia 94,00 ổ 0,00b
NT3: Frippak 150 + Artemia 95,33 ổ 1,15b
Giá trị thể hiện là số trung bình và ựộ lệch chuẩn
Các giá trị trong cùng một cột có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0.05)
0 20 40 60 80 100 120 NT1 NT2 NT3 Nghiệm thức T ỉ lệ s ốn g k h i số c fo rm on ( % )
Kết quả bảng 3.18 cho thấy khi sốc formol 150 mg/lắt trong 30 phút thì tỷ lệ sống của tôm ương bằng thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân cao hơn có ý nghĩa thống kê
(p < 0,05) so với hai nghiệm thức ựối chứng sử dụng thức ăn ngoại nhập Frippak và thức
ăn chế biến từ bột trùn quế chưa thủy phân, không có sự khác biệt về tỷ lệ sống khi sốc formol giữa hai nghiệm thức này. Theo hướng dẫn thực hành BMP của Viện Nghiên cứu môi trường Thủy Sản 1, tôm giống khi sốc formol 150 Ờ 200 ppm theo dõi trong vòng 30 phút tỷ lệ chết <10% có thể chấp nhận ựược [25]. Châu Tài Tảo và ctv (2006), ựánh giá bằng phương pháp gây sốc formol 150 ppm trong 30 phút nếu tỷ lệ tôm chết dưới 5% là tôm tốt [27]. Như vậy, có thể thấy sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân cho tôm giống có chất lượng cao hơn so với thức ăn chế biến từ bột trùn quế chưa thủy phân và các loại thức ăn ngoại nhập hiện ựang bán trên thị trường.
3.4.3 So sánh hiệu quả kinh tế giữa thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân và thức ăn ngoại nhập
để so sánh hiệu quả kinh tế giữa thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân và thức ăn ngoại nhập chúng tôi ựã tắnh toán giá thành sản phẩm. Chi phắ nguyên liệu và các chi phắ khác ựể sán xuất 1 kg thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân ựược trình bày theo bảng 3.19 và 3.20.
Bảng 3.19: Chi phắ nguyên liệu ựể sản xuất 1 kg thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân
Thành tiền (ựồng) Nguyên liệu
Giai ựoạn ấu trùng Giai ựoạn hậu ấu trùng
Bột trùn 150 067 120 530
Sữa, trứng, gluten 32 100 75 210
Các nguyên liệu khác 13 715 8 952
Bảng 3.20: Chi phắ ựể sản xuất 1 kg thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân
Thành tiền (ựồng)
Chi phắ Số lượng đơn giá
Giai ựoạn ấu trùng Giai ựoạn hậu ấu trùng Nguyên liệu điện Nước Nhân công Khác 10 0,5 7 người/30 kg 20% 2000 ự/kw 4000 ự/m3 50 000 ự/người 195 882 20 000 2 000 11 667 45 910 204 692 20 000 2 000 11 667 47 672 Tổng cộng 275 459 286 031
Chi phắ ựầu tư thiết bị (dự kiến 30 kg sản phẩm/ngày) 300 000 000 300 000 000 Khấu hao thiết bị cho 1 kg sản phẩm (5 năm) 5 479 5 479
Giá thành (ựồng/kg) 280 938 291 510
Bảng 3.21: Bảng giá tham khảo các loại thức ăn trên thị trường
Loại thức ăn Giá thành (ựồng/kg)
Frippak 1 Frippak 2 Frippak 150 1 830 000 1 830 000 598 000
So với thức ăn Frippak, thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân có giá thành rẻ. điều này mở ra một triển vọng cho việc sản xuất thức ăn cho ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú từ trùn quế giúp chúng ta chủ ựộng sản xuất thức ăn trong nước thay thế hàng ngoại nhập ựồng thời góp phần phát triển mô hình nuôi trùn quế phục vụ nuôi trồng thủy sản trong khu vực.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN & đỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN
1. Kết hợp tủa sơ bộ bằng aceton và các kỹ thuật sắc ký trao ựổi ion, tương tác kỵ nước và lọc gel ựã tinh sạch ựược hệ enzyme trùn quế tự phân gồm sáu protease FI, FII, FIII-1, FIII-2, FIII-3, FIV có khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 28 ựến 35 kDa.
2. đã xác ựịnh ựặc tắnh hóa học các protease trùn quế tự phân bao gồm :
+ Xác ựịnh ựược nhiệt ựộ, pH tối ưu; ựộ bền nhiệt, pH và ựiểm ựẳng ựiện các protease sau tinh sạch.
+ Các protease tinh sạch thuộc nhóm serine protease, FIV ựược xem như là một serine protease tương tự trypsin.
+ Các enzyme tinh sạch bảo quản ựược ắt nhất 10 tháng trong nước, riêng phân ựoạn FIII-3 nên trữ trong ựệm phosphate pH 7,5
+ Phân tắch ựược các ựoạn peptide của FIII-1 và FIII-2 có mức ựộ tương ựồng nhất ựịnh về thành phần amino acid với enzyme Lumbrokinase tinh sạch từ Lumbricus rubellus. + Các protease trùn quế ựều có khả năng thủy phân fibrin và fibrinogen, có thể ứng dụng trong y dược mở ra một hướng mới trong ựiều trị bệnh tim mạch.
3. Xác ựịnh ựược các ựiều kiện thắch hợp cho quá trình tự phân trùn quế
+ Hiệu suất thủy phân ựạt cao nhất 46,2% tương ứng với tỷ lệ pha loãng trùn quế ựạt hàm lượng protein 9%, nhiệt ựộ 55oC, thời gian 24 giờ và môi trường thủy phân là nước. + Sản phẩm tự phân trùn quế qua sấy phun cho bột ựạm có chất lượng tốt ựạt các chỉ tiêu an toàn về mặt vi sinh và chứa ựầy ựủ các amino acid thiết yếu.
4. Sử dụng bột trùn quế tự phân phối trộn nuôi thử nghiệm ấu trùng tôm sú ựạt hiệu suất rất khả quan.
+ Thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân cho kết quả tăng trưởng chiều dài tốt hơn thức ăn chế biến từ bột trùn quế chưa thủy phân từ giai ựoạn Postlarvae-1 ựến Postlarvae-15 và thức ăn ngoại nhập Frippak từ Postlarvae-10 ựến Postlarvae-15.
+ Thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân không ảnh hưởng ựến tỷ lệ sống của ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú nhưng cho tôm Postlarvae-15 có chất lượng tốt nhất.
4.2 đỀ NGHỊ
- Giải trình tự các phân ựoạn protease từ trùn quế có hoạt tắnh cao nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu tái tổ hợp enzyme.
- Ứng dụng quy trình thu nhận và tinh sạch protease từ trùn quế với số lượng lớn và tiến hành kiểm tra các tiêu chuẩn dược học ựể có thể sử dụng trên cơ thể người.
- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất nhằm nâng cao chất lượng bột ựạm từ trùn quế làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú như khả năng kết dắnh, giảm ựộ hòa tan, tăng thời gian bảo quản sản phẩm.
- Tiếp tục thử nghiệm bột trùn quế thủy phân trên các ựối tượng ấu trùng tôm càng xanh, các loại cá bột, mở rộng phạm vi ứng dụng làm thực phẩm chức năng cho người nâng cao giá trị sử dụng của sản phẩm tự phân của trùn quế.
PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.1 Xác ựịnh ựộ ẩm
Cân 5 gam mẫu ựem ựi sấy ở nhiệt ựộ 105ồC ựến khối lượng không ựổi. Thường thời gian sấy khoảng 8-10 giờ thì ựạt. Cân khối lượng trước và sau khi sấy, tắnh ra phần trăm ựộ ẩm có trong mẫu vật. m0 Ờ m1 W = 5 x 100% Trong ựó: W: độ ẩm (%)
m0: Khối lượng chén và mẫu trước khi sấy (g) m1: Khối lượng chén và mẫu sau khi sấy (g)
1.2 Xác ựịnh hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
1.2.1 Nguyên tắc
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô ựược gọi là nitơ tổng số, nitơ có trong thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong thành phần protein như các muối vô cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các peptid, ureẦ là nitơ phi protein.
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
Trước tiên mẫu ựược vô cơ hóa bằng H2SO4 ựậm ựặc ở nhiệt ựộ cao và có chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:
2H2SO4 → 2H2O + 2SO2↑ + O2
Oxy tạo thành trong phản ứng lại oxy hóa các nguyên tố khác, Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
NH3 + H2SO4→ (NH4)2SO4
đẩy NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH, hấp thụ NH3 bằng dung dịch H3BO3 có chứa chất chỉ thị, sau ựó ựem chuẩn ựộ bằng dung dịch H2SO4 0,1N
(NH4)2SO4 + NaOH → Na2SO4 + H2O + 2NH3 2NH4OH + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 7H2O
(NH4)2B4O7 + H2SO4→ (NH4)2SO4 + H3BO3
1.2.2 Tiến hành
* Vô cơ hóa mẫu
Cân khoảng 0,3 - 0,5 gam mẫu cho vào bình Kjeldahl, thêm vào 10ml H2SO4 ựậm ựặc và một ắt bột xúc tác ựun trên bếp. Nhiệt ựộ và thời gian gia nhiệt ựược chọn tuỳ thuộc vào mẫu phân tắch (nhiệt ựộ 300 - 4000C). Vô cơ hóa mẫu ựến khi thu ựược dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4, ựể nguội ựến nhiệt ựộ phòng.
* Chuẩn bị chưng cất ựạm
Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3, dùng pipet cho vào bình hứng 20ml acid boric, có thêm 6 giọt chất chỉ thị (Bromocresolgreen và metyl ựỏ) ựặt bình vào hệ thống sao cho ựầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch.
Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, lắp bình Kjeldahl vào hệ thống cất ựạm.
Sau ựó thêm vào khoảng 10ml NaOH 30%. Quan sát khi dung dịch trong bình chuyển sang màu xanh ựen, chứng tỏ dung dịch trong bình cất ựã ựủ kiềm ựể ựẩy NH3 ra khỏi (NH4)2SO4. Bắt ựầu chưng cất ựạm cho ựến khi dung dịch trong bình hứng ựạt 80 - 100ml (thời gian khoảng 5 phút). Dùng nước cất ựể rửa ựầu ống sinh hàn, lấy bình hứng ra và ựem ựi chuẩn ựộ bằng H2SO4 0,1N. 1.2.3 Tắnh kết quả 0,00142 x VH2SO4 x 100 Hàm lượng nitơ tổng số (%) = m Trong ựó: V: thể tắch H2SO4 0,1 N dùng ựể chuẩn ựộ (ml) m: khối lượng nguyên liệu vô cơ hóa (g)
0,00142: Số g nitơ tương ựương với 1 ml H2SO4 0,1N
Dựa vào tỷ lệ nitơ tương ựối trong thành phần protein ựể xác ựịnh hệ số protein. Hàm lượng nitơ toàn phần trong protein ựộng vật khoảng 16 %, khi ựó hệ số protein K là:
K = 100/16 = 6,25 Hàm lượng protein tổng số (CP) ựược tắnh theo công thức:
Hàm lượng protein ựược xác ựịnh theo phương pháp Lowry [61]
* Chuẩn bị hóa chất:
Pha dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N; Dung dịch B1: CuSO4 1%; Dung dịch B2: Kali-Natri tartrat 2%
Dung dịch C = B1 : B2: A = 0,5: 0,5: 50
* Xây dựng ựường chuẩnBSA: Dung dịch BSA gốc 1mg/ml pha trong H2O.
Bảng 2.1 Xây dựng ựường chuẩn với các nồng ựộ BSA khác nhau
Nồng ựộ (ộg/ml) 0 40 80 120 160 200 240 280 320
V BSA( ộl) 0 20 40 60 80 100 120 140 160
V H2O (ộl) 500 480 460 440 420 400 380 360 340
V dd C (ml ) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
V TT Folin 1N (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1
để yên 30 phút. đo ở bước sóng 750 nm.
* Tiến hành ựo mẫu protein tương tự như các mẫu ở ựường chuẩn.
Phân tắch kết quả dựa trên ựường chuẩn ựã xây dựng. Mỗi mẫu phân tắch 3 lần lặp lại lấy kết quả trung bình
1.4 Xác ựịnh hoạt tắnh protease trên casein
+ Hoạt tắnh protease thủy phân casein ựược xác ựịnh theo phương pháp Anson cải tiến [4] với cơ chất casein 1%.
đơn vị hoạt tắnh enzyme biểu hiện qua tyrosine unit (U)/mg protein. Một ựơn vị enzyme là lượng enzyme cần thiết xúc tác thủy phân casein, tương ựương 1 ộmol tyrosine sinh ra trong một phút ở 30oC; pH 7,5.
* Dựng ựường chuẩn Tyrosine
Nồng ựộ(ộmol/ộl) 0 0,1 0,15 0,2 0,25 0,5 0,6 1
V Tyrosine (ộl) 0 50 75 100 125 250 300 500
V HCl 0,2 M (ộl ) 500 450 425 400 375 250 200 0 V Na2CO3/NaOH (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 V TT Folin 1N (ộl) 100 100 100 100 100 100 100 100
Lắc ựều các ống nghiệm. để yên 30 phút ở nhiệt ựộ phòng. đo ở bước sóng 750 nm.
* đo hoạt tắnh enzyme:
Mẫu ựối chứng: Cho 400 ộl dung dịch ựệm + 200ộl dịch chiết enzyme + 600ộl TCA 10% + 200 ộl casein 1%.
Mẫu enzyme: Cho 400 ộl dung dịch ựệm + 200 ộl dịch chiết enzyme + 200 ộl casein 1%. Ủ ở 30oC trong 10 phút + 600 ộl TCA 10%.
Ly tâm mẫu ựối chứng và mẫu enzyme ở 13000 vòng/phút trong 10 phút. → Lấy 500 ộl dịch sau ly tâm + 2,5 ml Na2CO3 /NaOH + 100ộl thuốc thử Folin. để yên 30 phút. đo ở bước sóng 750 nm.
Mỗi mẫu phân tắch ựo hoạt tắnh gồm 1 ựối chứng và 3 mẫu có enzyme, lấy kết quả trung bình.
1.5 Kỹ thuật ựiện di trên gel SDS-PAGE [53]
1.5.1 Nguyên tắc
Kỹ thuật ựiện di dựa trên nguyên tắc trong một ựiện trường các phân tử tắch ựiện âm sẽ di chuyển về cực dương của ựiện trường và ngược lại. Tốc ựộ di chuyển của các phân tử này tùy thuộc vào kắch thước, hình dạng, ựiện tắch và lực ựiện trường.
1.5.2 Tiến hành
Hóa chất
* Dung dịch pha mẫu có chứa: Tris-HCl, pH; SDS 10%; Glycerol; β-mercaptoetanol và Bromophenol blue
* Dung dịch chạy ựiện di có chứa: 3g Tris; 14,4 g Glycine; 1g SDS *Dung dịch nhuộm gel: Comassie R-250 pha trong dung dịch methanol
Ớ Các bước chạy ựiện di:
* Chuẩn bị hộp ựiện di: Khuôn kắnh ựể ựổ gel, lược cài và hộp ựiện di phải ựược rửa sạch và lau khô bằng cồn. Sau ựó ráp thành khuôn ựể chuẩn bị ựổ gel.
* Chuẩn bị mẫu ựiện di:
Pha mẫu tỷ lệ 1 : 2. Cho vào ống eppendorf 100 ộl mẫu chứa protein và 200 ộl dung dịch ựệm pha mẫu ựã chuẩn bị.
Lắc ựều và ựun cách thủy ở 95ồC, 5 phút. để nguội.
* Chuẩn bị gel phân tắch và gel tập trung polyacrylamide 12%:
Dung dịch gel phân tắch và tập trung gồm H2O; Acrylamide 30% (Bio-Rad), Tris-HCl pH 8; SDS 10% và ammonium per sulfate (APS) ựược trộn lẫn bằng máy khuấy từ. Sau ựó cho một ắt TEMED vào dung dịch, khuấy ựều và nhanh chóng dùng pipet 1000 ml cho vào khung kiếng ựổ gel. Gel sẽ ựược bơm ựến vạch cách lược là 0,5 cm. Chú ý không bơm quá nhanh sẽ tạo bọt trong gel.
Cẩn thận bơm tiếp một lớp nước cất lên trên bề mặt gel ựể tạo cho bề mặt gel phẳng. Gel sẽ ựông lại sau 20 - 30 phút.
Khuấy ựều dung dịch trên máy khuấy từ. Trước khi ựổ gel tập trung, ta phải ựổ bỏ phần nước phắa trên gel phân tắch bằng cách nghiêng và dùng giấy thấm.
Tương tự gel phân tắch, sau khi cho TEMED vào, dung dịch phải ựược ựưa nhanh vào khung ựổ gel. Dùng giấy thấm ựể loại hết nước trên bề mặt gel phân tắch. Cho gel tập trung vào,