Thu nhận các ựiểm protein trên ựiện di ựồ sau khi chạy ựiện di một chiều hoặc hai chiều. Tiến hành phân cắt chúng bằng các enzyme ựặc hiệu thành hỗn hợp các peptide, sau ựó sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF hoặc ESI-MS-MS ựể lập bản ựồ khối lượng peptide kết hợp nghiên cứu dữ liệu trình tự protein không giới hạn NRDB (Non-redundant protein sequence database) trên website [118].
Quy trình trên ựược tóm lược theo sơ ựồ hình 1.8:
Hình 1.8: Quy trình lập bản ựồ phân tắch protein theo phương pháp phổ khối lượng
Mẫu phân tắch Tách protein 1-DE or 2-DE Thủy phân protein Phân tắch MS. Lập bản ựồ peptid
Nghiên cứu dữ liệu. Xác ựịnh protein
đây là kỹ thuật hiện ựại có ựộ chắnh xác khá cao và tiện lợi về mặt tốc ựộ phân tắch ựể xác ựịnh trình tự amino acid trong phân tử protein nên thường ựược áp dụng trong các phòng thắ nghiệm hiện nay. Nếu ựạt kết quả có thể sử dụng ựể giải trình tự nucleotide và nhân dòng với gen tương thắch.
Chọn enzyme cắt: Chọn enzyme cắt tạo ra các peptide có khối lương tương thắch với phân tắch phổ khối lượng MS và nghiên cứu dữ liệu ựể có ựộ chắnh xác ựắch thực. Một vài tắnh chất chuyên biệt của enzyme ựược trình bày ở bảng 1.4:
Bảng 1.5: Tắnh chất enzyme cắt chuyên biệt phân giải protein trong phân tắch MS
Protease Vị trắ cắt chuyên biệt Phân tắch MS Nghiên cứu dữ liệu Trypsin Cắt chọn lọc rất cao ở ựầu
C của Arg &Lys
Tuyệt hảo, peptide tạo ựược có kắch thước 500-2500Da. Có hạn chế tự phân hủy.
Tốt, chỉ có 2 amino acid phải xem xét cho ựầu cuối C
Lys-C* Cắt ựộc quyền ở ựầu cuối C của Lys có tắnh chuyên biệt cao
Tốt. Peptide tạo ra khá lớn thắch hợp cho nghiên cứu phosphopeptide. Không tự hủy. Làm việc với MS-MS bị ảnh hưởng các mạch nhánh Arg nội phân tử.
Tốt, chỉ có 1 amino acid phải xem xét cho ựầu cuối C
Glu-C** Phụ thuộc pH, cắt ở ựầu C của Glu (pH4); Glu & Asp (pH7), khả năng cắt chuyên biệt trung bình
Trung bình, tái tạo lại các peptide tự phân cắt. Làm việc với MS-MS bị ảnh hưởng các mạch nhánh Arg, Lys nội phân tử
Tốt, chỉ có 2 amino acid phải xem xét cho ựầu cuối C
*Lys-C là enzyme thuộc nhóm serine protease có khối lượng phân tử 33kDa
**Glu-C hay còn gọi là V8-protease thuộc nhóm serine protease có khối lượng phân tử 30kDa
Yêu cầu quan trọng nhất là phải cắt ựặc hiệu tại các vị trắ cắt chuyên biệt. Ngoài ra cần chú ý ựến kắch thước trung bình của peptide tạo thành. Trypsin cho số lượng lớn các peptide nhỏ, trong khi Lys-C lại cho số lượng peptide ắt nhưng phân tử có kắch thước khá lớn. Một trình tự amino acid ựược xác ựịnh dễ dàng nếu phân tắch từ các peptide có kắch thước nhỏ hơn là peptide có kắch thước lớn. Vì thế gần như tất cả các yêu cầu cho phân tắch phổ khối lượng và nghiên cứu dữ liệu thì trypsin là protease ựược sử dụng phổ biến nhất cho các ứng dụng trong thực tế. Các peptide tạo thành từ sự phân giải protein bởi trypsin có khối lượng phân tử khoảng 500-2500Da ựáp ứng ựược yêu cầu phân tắch của phương pháp phổ khối lượng. Hơn nữa các amino acid base chắc chắn nằm ở ựầu cuối của chuỗi peptide, vì vậy dễ dàng dự ựoán bởi sắc phổ ựồ MS-MS [93].
Xác ựịnh protein dựa trên bản ựồ khối lượng peptide
Protein sau khi bị phân giải bởi enzyme cắt chuyên biệt thu hỗn hợp các peptide và ựược tách ra bằng phổ khối lượng MALDI-TOF-TOF hoặc ESI-MS-MS ựể xác ựịnh khối lượng phân tử chắnh xác các peptide này. Sau ựó so sánh với tất cả các dữ liệu về trình tự amino acid của các peptide hoặc dịch mã thành trình tự nucleotide trên các website. để lập bản ựồ peptide của một protein một cách chắnh xác và có ý nghĩa thống kê thì khối lượng peptide xác ựịnh thực tế và tắnh toán phải ựược xem xét qua hai thông số sau: - đoạn peptide có khối lượng ựã xác ựịnh trong thực nghiệm ựược so sánh tương ựồng (match) với peptide có khối lượng biết trước từ những protein có trong dữ liệu, nếu càng gần loài hoặc nhóm với nhau thì ựộ tin cậy càng cao.
- Số lượng các peptide sử dụng ựể so sánh với các dữ liệu trên một phần mềm nào ựó càng lớn thì tắnh chuyên biệt càng cao.
Khối lượng chắnh xác của các peptide phân tắch là vấn ựề quan trọng. Hiện nay, công cụ thực hiện thường là MALDI kết hợp với phổ kế thời gian bay phản xạ (R-TOF) là lý tưởng nhất ựể nghiên cứu các dữ liệu với sự chắnh xác trong dãy 30-50ppm.
Các kỹ thuật nghiên cứu khối lượng peptide chắnh xác cũng ựược ựưa vào trong tiến trình thắ nghiệm như thiết lập ựường cong nội chuẩn, bằng cách trộn vào mẫu phân tắch trypsin ựã biết trình tự amino acid, enzyme này có khả năng tự thủy phân chắnh nó tạo ra các peptide có khối lượng chắnh xác. Mặc khác sự cải biến các mạch nhánh của amino acid ựặc biệt như cysteine, methionine, hoặc metyl hóa các nhóm carboxyl của ựoạn peptide nhằm có thể suy ựoán trình tự các amino acid trong ựoạn peptide. Dưới ựây là một vài tiêu chuẩn khi xác ựịnh protein bằng bản ựồ khối lượng peptide:
+ Protein mục tiêu phải ựứng ựầu bảng trong danh sách các peptide ựược so sánh tương ựồng trên dữ liệu.
+ Ít nhất có 5 peptide ựược phát hiện ựể cho sự so sánh tương ựồng có ý nghĩa.