Enzyme thủy phân fibrin có nguồn gốc từ ựộng vật: Loài trùn ựất Lumbricus rubellus
ựã ựược phát hiện tại Nhật [81], [82], có khả năng thủy phân mạnh fibrin và sau ựó ựược tinh sạch gồm 6 isozyme ựều có khả năng ựó và ựược ựặt tên là Lumbrokinase. Tiếp theo là các nghiên cứu trên lọai trùn này ở Hàn Quốc [46], [47] cũng ựã tinh sạch, khảo sát các ựặc ựiểm, giải trình tự nucleotide và nhân dòng gen mã hóa lumbrokinase có hoạt tắnh thủy phân fibrin cao. Năm 1997, Yang J.S ựã tách chiết enzyme thủy phân fibrin ựược hoạt hóa bởi SDS có nguồn gốc từ loài trùn ựất Eisenia fetida [112]. Bằng các kỹ thuật sắc ký trên gel DEAE sepharose, sephadex G-75 và phenyl sepharose ựã tinh sạch ựược loại enzyme có khối lượng phân tử 45kDa gồm hai tiểu ựơn vị, tiểu ựơn vị lớn 26kDa và tiểu ựơn vị nhỏ 18kDa gắn kết với nhau bằng các liên kết tương tác kỵ nước. Enzyme thủy phân fibrin ựược tách chiết từ sâu bướm Lonomia achelous ở Venezuela bởi Coll-Sangrona. E và ctv (1998) [52] có hoạt tắnh khoảng 100 ựơn vị urokinase/mL. Enzyme này có khả năng phân hủy các cục máu ựông với tốc ựộ chậm hơn so với sự thủy phân của plasmin. Các vị trắ cắt của enzyme này trên phân tử fibrinogen khác với các vị trắ cắt của plasmin.
Dametto và ctv, năm 2000 ựã tinh sạch ựược enzyme giống trypsin có khả năng thủy phân fibrin từ một giống ruồi Haematobia irrtans. Bằng cột sắc ký ái lực chuyên biệt
SBTI-sepharose ựã tách ựược enzyme có khối lượng phân tử 25,5 kDa hoạt ựộng ở pH tối ưu bằng 9 và thủy phân ựược cơ chất tổng hợp H-D Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide ựặc trưng cho enzyme giống trypsin và có thể thủy phân cả fibrinogen và fibrin với hoạt tắnh rất cao [93].
Enzyme thủy phân fỉbrin từ vi sinh vật: Năm 1987, Sumi sau nhiều năm nghiên cứu về enzyme phân giải cục máu nghẽn và tìm kiếm tác nhân tự nhiên có thể hòa tan cục nghẽn liên quan ựến nhồi máu cơ tim ựã phát hiện ra nattokinase cũng là một enzyme có khả năng thủy phân fibrin mạnh. Nattokinase ựược chiết tách và tinh sạch từ ựậu nành lên men có tên gọi Natto, là một lọai thực phẩm truyền thống của Nhật Bản. Quá trình lên men ựược bổ sung vi khuẩn Bacillus natto vào dịch ựậu nành ựã ựược nấu chắn và chắnh lọai vi khuẩn này sản sinh enzyme nattokinase [114].
Tiếp theo là hàng loạt các nghiên cứu trên ựối tượng vi sinh vật ở Hàn quốc, Kim W.K và ctv (1996) ựã tinh sạch enzyme thủy phân fibrin từ Bacillus sp CK 11-4 ựược chiết tách từ nước sốt ựậu nành lên men [75]. Một nghiên cứu khác của Kim H.K và ctv cũng tinh sạch và khảo sát các ựặc ựiểm thủy phân fibrin từ Bacillus sp KA38 có nguồn gốc từ cá muối lên men [73]. Douchi là loại thực phẩm lên men từ ựậu nành Trung Quốc cũng ựược Wang và ctv (2006) ựã chiết tách và xác ựịnh các tắnh chất một enzyme thủy phân mạnh fibrin và fibrinogen từ chủng Bacillus subtilis DC33 có khối lượng phân tử khoảng 30kDa, với hoạt tắnh 418 IU cho mỗi ml môi trường nuôi cấy LB [117].
Một enzyme thủy phân fibrin có tắnh chất giống chymotrypsin thuộc nhóm protease kim loại, bị kìm hãm bởi EDTA và EGTA cũng ựược phát hiện bởi Park và ctv năm 2007, tinh sạch từ môi trường lên men nấm Flammulina velutipes [90].
Enzyme thủy phân fibrin có nguồn gốc từ thực vật: Việc nghiên cứu các enzyme có hoạt tắnh thủy phân fibrin cao không chỉ dừng lại ở các ựối tượng ựộng vật và vi sinh vật mà còn khai thác cả trên thực vật. Choi và Sa (2001) ựã tách chiết và khảo sát ựặc tắnh của enzyme thủy phân fibrin từ loài bèo tấm Spirodela polyzhira là loại enzyme có hai sợi polypeptide với khối lượng phân tử 145kDa và 70kDa. Với khả năng thủy phân ựược không những cơ chất fibrinogen, fibrin mà còn có hoạt tắnh kháng thrombin. Vì vậy có thể sử dụng trong ựiều trị lâm sàng ựối với bệnh nghẽn mạch [53]. Kim J.S và ctv (2006)
ựã tinh sạch enzyme protease trung tắnh từ loại nấm ăn chữa bệnh Cordyceps militaris
(Hàn Quốc) với khối lượng phân tử 52 kDa có khả năng thủy phân nhanh mạch α, mạch γ-γ của fibrin và thủy phân mạch β fibrin nhưng chậm hơn [14].
Như vậy với vai trò quan trọng của nhóm enzyme thủy phân fibrin trong ựiều trị bệnh tim mạch nên việc tinh sạch và khảo sát các ựặc tắnh hóa học của nó trên các ựối tượng khác nhau là ựiều cần thiết. Qua ựó ựã chứng minh ựược việc sử dụng các loài trùn ựất trong các bài thuốc dân tộc ở phương đông nói chung và Việt Nam nói riêng ựể ngăn ngừa và ựiều trị bệnh tim mạch là hoàn toàn có cơ sở khoa học.
1.2.4 Ứng dụng protease trong quá trình tự phân protein
1.2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng ựến qúa trình tự phân
Quá trình tự phân của trùn quế thực chất là quá trình thủy phân protein trùn quế dưới tác ựộng của hệ enzyme protease nội sinh. Vì vậy các yếu tố ảnh hưởng ựến quá trình tự phân cũng chắnh là các yếu tố ảnh hưởng ựến phản ứng có enzyme xúc tác. Thông thường các yếu tố này bao gồm pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ enzyme và cơ chất, lượng nước bổ sung, thời gian thủy phân và diện tắch tiếp xúc.
Ảnh hưởng của pHlên quá trình tự phân
pH ảnh hưởng rất lớn ựến hoạt tắnh enzyme do liên quan ựến sự tương tác giữa enzyme và cơ chất. Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào ựiện tắch phân bố trên cả enzyme lẫn cơ chất, cụ thể là trung tâm hoạt ựộng của phân tử enzyme. Mỗi enzyme chỉ hoạt ựộng mạnh nhất ở một pH xác ựịnh, gọi là pH tối ưu. pH tối ưu cho hoạt ựộng của nhiều enzyme vào khoảng 7. pH quá cao hay quá thấp có thể làm enzyme bị biến tắnh. pH tối ưu của mỗi enzyme có thể thay ựổi trong một khoảng nhất ựịnh tùy theo tắnh chất và nồng ựộ cơ chất, nhiệt ựộ và bản chất của các loại dung dịch ựệm [4].
Ảnh hưởng của nhiệt ựộ lên quá trình tự phân
Bản chất của enzyme là protein do ựó nhiệt ựộ có ảnh hưởng rất lớn ựến vận tốc phản ứng. Nhiệt ựộ tăng tốc ựộ phản ứng tăng nhưng ựến mức nào ựó thì tốc ựộ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tắnh. đa số enzyme có nhiệt ựộ tối ưu khoảng 40 - 50ồC. Ở nhiệt ựộ trên 70oC phần lớn các enzyme ựều mất hoạt tắnh. Nhiệt ựộ tối ưu của các enzyme khác nhau thì không giống nhau, chúng tùy thuộc vào nguồn gốc sản sinh ra
chúng. Phần lớn nhiệt ựộ tối ưu của enzyme từ vi sinh vật, thực vật cao hơn ựộng vật [24]. Nhiệt ựộ tối ưu của mỗi enzyme không cố ựịnh mà thay ựổi theo thời gian thủy phân, nồng ựộ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng tồn tại của enzyme [4].
Ảnh hưởng của nồng ựộ enzyme và cơ chất trong quá trình tự phân
Trong trường hợp cơ chất ựầy ựủ, nồng ựộ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc ựộ phản ứng [18]. Nhưng nếu tăng nồng ựộ enzyme cao quá sẽ không có hiệu quả kinh tế, ngược lại nếu cơ chất quá nhiều sẽ ảnh hưởng ựến tốc ựộ phản ứng enzyme. Vì vậy cần nghiên cứu chọn nồng ựộ enzyme phù hợp với lượng cơ chất nhất ựịnh. Trong quá trình tự phân ựôi lúc sản phẩm sinh ra cũng có thể ức chế hoạt ựộng của enzyme, làm cho phản ứng xảy ra chậm và ảnh hưởng ựến chất lượng sản phẩm [109].
Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung trong quá trình tự phân
Trong phản ứng thủy phân protein bằng enzyme, nước không những là môi trường ựể khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia phản ứng. Lượng nước cho vào nếu ắt quá thì tác dụng thủy phân của enzyme kém nhưng nếu nhiều quá thì sẽ tạo ựiều kiện thuận lợi cho vi sinh vật hoạt ựộng làm ảnh hưởng ựến chất lượng của dịch ựạm thủy phân. đối với quá trình tự phân trùn quế ựể sản xuất bột ựạm amine thì lượng nước bổ sung ngoài ảnh hưởng ựến việc tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất còn ảnh hưởng ựến quá trình sấy khô sản phẩm, vì vậy cần nghiên cứu ựể chọn ựược tỷ lệ nước bổ sung thắch hợp là cần thiết.
Ảnh hưởng của thời gian tự phân
Theo một số nghiên cứu thì mức ựộ thủy phân tăng vọt trong thời gian ựầu của phản ứng, sau ựó tốc ựộ phản ứng chậm lại. Thời gian thủy phân dài hơn, cần sử dụng lượng enzyme lớn hơn thì mức ựộ thủy phân mới có thể cao hơn. Thời gian thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kắch thước nguyên liệu, cấu trúc, loại protein Ầ
Ảnh hưởng của diện tắch tiếp xúc
Diện tắch tiếp xúc cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng ựến quá trình thủy phân. để tạo ựiều kiện tốt hơn cho quá trình thủy phân cần tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, muốn vậy cần làm nhỏ kắch thước cơ chất trước khi thủy phân.
Như vậy có nhiều yếu tố ảnh hưởng ựến quá trình thủy phân trùn quế bằng phương pháp sử dụng protease nội sinh, vì vậy cần phải phối hợp hài hòa giữa các yếu tố giúp qúa trình tự phân ựạt hiệu suất cao nhất nhằm tạo bột ựạm ựạt chất lượng cao về hàm lượng ựạm amine và cả ựộ an toàn về mặt vi sinh thực phẩm.
1.2.4.2 Các phương pháp ựánh giá hiệu suất quá trình thủy phân protein
Trong quá trình thủy phân protein thông số theo dõi phản ứng là hiệu suất thủy phân. Hiệu suất thủy phân ựược xác ựịnh là % của lượng nitơ ựạm amine tạo ra trong dịch thủy phân trên lượng nitơ của ựạm tổng số [79].
MN x100 Trong ựó : Hiệu suất thủy phân (N%) =
MN tổng số N: hiệu suất thủy phân (%)
MN: lượng nitơ ựạm amine dịch thủy phân MN tổng số : lượng nitơ ựạm tổng số
Một vài phương pháp thông dụng ựể theo dõi hiệu suất thủy phân là pH-stat, chuẩn ựộ formol, ựo ựộ nhớt, xác ựịnh hàm lượng nitơ hòa tan hoặc xác ựịnh hàm lượng nhóm amine bằng phương pháp Trinitro-benzene sulfonic acid (TNBS) hoặc phương pháp ortho-phthaldialdehyde. Mỗi phương pháp ựều có những ưu và nhược ựiểm khác nhau, những phương pháp xác ựịnh nhanh có thể cho ựộ chắnh xác không cao. Sau ựậy là bảng tóm tắt nguyên tắc các phương pháp xác ựịnh hiệu suất thủy phân protein thông dụng.
Bảng 1.2 Nguyên tắc các phương pháp xác ựịnh hiệu suất thủy phân
Phương pháp Nguyên tắc Tham khảo
pH-stat
đo ựộ nhớt Chuẩn ựộ formol TNBS
OPA
Giữ pH không ựổi suốt tiến trình thủy phân, số lượng base sử dụng tỉ lệ với lượng amine tạo ra
Theo dõi sự thay ựổi ựộ nhớt bằng máy ựo ựộ nhớt Chuẩn ựộ nhóm amine với formadehyde
2,4,6-Trinitro-benzene sulfonic acid phản ứng với nhóm amine tạo hợp chất có màu
Ortho -phthaldialdehyde phản ứng với nhóm amine bậc 1 tạo hợp chất hấp thụ ở bước sóng 340nm [86] [86] [79] [88] [87]
1.3 Kỹ thuật thu nhận, tinh sạch và phân tắch protein hiện ựại
Protein là hợp chất hữu cơ cao phân tử, do tế bào sống tổng hợp nên và hoạt ựộng tốt trong môi trường cơ thể chắnh nó. Trong thực tế ựể ứng dụng protein có hoạt tắnh sinh học một cách hiệu quả, chẳng hạn ựối với protein là enzyme do chúng không những xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi nó vẫn có thể hoạt ựộng cho các phản ứng ở ngoài tế bào. Vì thế việc tinh sạch protein nhằm hiểu rõ hơn về tắnh chất lý hóa học của nó như khối lượng phân tử protein, nhiệt ựộ và pH tối ưu, ựộ bền pH, nhiệt ựộ theo thời gian, các tác dụng sinh lý trên invitro là ựiều không thể thiếu trong các nghiên cứu cơ bản.
Ngày nay, với sự phát triển các thiết bị và kỹ thuật tiên tiến giúp cho các phương pháp phân tắch, tinh sạch những hợp chất có phân tử lượng lớn ngày càng trở nên dễ dàng hơn. đặc biệt trong lĩnh vực tinh sạch protein với hàm lượng nhỏ ựược thực hiện, ngoài ý nghĩa trên chúng còn ựược nghiên cứu sâu hơn về sự biến ựổi sau giải mã và chức năng sinh học của protein [107].
Các protein có hoạt tắnh sinh học sau khi tinh sạch sẽ ựược thủy phân bằng các enzyme cắt ựặc hiệu. Sau ựó dùng kỹ thuật sắc ký tách các ựoạn peptide và giải trình tự amino acid các ựoạn peptide này theo phương pháp Edman. Hiện nay việc phân tắch này có thể tiến hành nhanh hơn với lượng mẫu phân tắch rất nhỏ nhờ phương pháp phổ khối lượng MS-MS hoặc MALDI-TOF. Tiếp theo việc xác ựịnh này là giải trình tự nucleotide của ựoạn gen mã hóa cho ựoạn peptide trên, tiến xa hơn nữa là sản xuất enzyme, kháng thể, vacxinẦ bằng con ựường công nghệ sinh học. Bên cạnh ựó, việc tinh sạch protein ựể nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều dạng tinh thể bằng kỹ thuật X-Ray nhằm xác ựịnh mối quan hệ giữa chức năng và cấu trúc phân tử protein hoặc cơ chế xúc tác của enzyme cũng là một trong những vấn ựề hiện nay ựược các nhà khoa học quan tâm.
Như vậy một nghiên cứu cơ bản về tinh sạch protein cần ựi theo trình tự các bước từ thu nhận, tìm kỹ thuật tinh sạch, kiểm tra hoạt tắnh, xác ựịnh các ựặc tắnh hóa học và phân tắch sâu hơn là trình tự amino acidẦ.Trong mỗi bước cần phải chú ý ựến các ựiều kiện và kỹ thuật cụ thể ựể thu ựược một protein còn hoạt tắnh sinh học, có ựộ tinh sạch cao.
1.3.1 Thu nhận và xử lý mẫu
1.3.1.1 Nguyên liệu
Protein ựược tinh sạch rất ựa dạng bao gồm các protein hòa tan, protein màng hoặc protein vách tế bào ở dạng liên kết cộng hóa trị. Ngoài các nguyên liệu từ mô ựộng thực vật và vi sinh vật hoang dại, còn có các vi sinh vật ựược tạo ra bằng kỹ thuật di truyền hoặc các sản phẩm protein tái tổ hợp cũng là ựối tượng ựược chiết tách và tinh sạch. Một số nguyên liệu có thành phần protein hòa tan tương ựối sạch như huyết thanh, nước tiểu, nọc rắn, hoặc môi trường ngoại bào từ việc nuôi cấy vi sinh vật ựều thắch hợp cho việc ựưa trực tiếp vào cột sắc ký sau khi ly tâm, lọc hoặc có thể cô ựặc trước khi qua cột tinh sạch. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, nguyên liệu lấy trực tiếp từ mô ựộng thực vật, protein màng hoặc vách tế bào thì các thành phần khác sẽ gây khó khăn cho việc chiết tách. Các khó khăn thường gặp khi chiết tách một protein là sự biến tắnh, sự tự thủy phân và các tạp chất có trong mẫu phân tắch như chất màu, acid nucleic, vi khuẩnẦ Tuy vậy, trong một số trường hợp cũng có thể giảm bớt một số vướng mắc trên bằng cách rút ngắn thời gian chuẩn bị và chiết tách ở nhiệt ựộ thấp. Thời gian chuẩn bị càng nhanh càng tốt và ở nhiệt ựộ thấp nhất nếu có thể, ựồng thời tìm mọi biện pháp ựể loại bỏ các tạp chất có trong mẫu là ựiều cần thiết [51].
1.3.1.2 Một số thiết bị nghiền mẫu và phá vỡ tế bào dùng trong chiết tách mẫu
* Phá vỡ các mô mềm:
+ Máy nghiền ựơn giản, thiết bị ựồng hóa mẫu hoặc thiết bị nghiền mẫu potter.
* Phá vỡ các mô cứng : thường là các loại hạt, chúng ựược ngâm trong nước hoặc dung dịch ựệm. Sau ựó nghiền bằng cối xay hoặc cối chày thông thường. đôi khi cũng có thể nghiền trực tiếp trong nitơ lỏng.
* Vi khuẩn hoặc nấm men:
+ Phá vách tế bào bởi protease, dùng sóng siêu âm hoặc sử dụng áp suất [101].
1.3.1.3 Các yếu tố cần chú ý khi chiết tách protein
Dung dịch ựệm pH: pH có ảnh hưởng rất lớn ựến cấu trúc không gian của protein, vì thế nó cũng ảnh hưởng ựến chức năng sinh học của các phân tử này. Thông thường giá trị pH sử dụng sao cho protein có hoạt tắnh tối ựa. Tuy vậy ựó cũng chưa phải là giá trị pH
cho hiệu quả chiết tách tốt hoặc ổn ựịnh nhất. Vắ dụ trypsin hoạt ựộng tốt nhất ở pH 8-9 nhưng nó lại ổn ựịnh ở pH 3, vì tại giá trị pH này sự tự hủy có thể ựược tránh khỏi. Việc