- Thắ nghiệm ựược bố trắ hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố E: Thời gian tự phân giải với 6 mức ựộ:
E1 = 1 giờ E2 = 4 giờ E3 = 8 giờ E4 = 12 giờ E5 = 24 giờ E6 = 36 giờ - Tổng số thắ nghiệm là: 6 * 3 = 18
Tiến hành: Cân bột trùn quế vào các ống eppendorf, bổ sung loại dung dịch chọn từ thắ nghiệm 2.2.3.2 sao cho ựạt nồng ựộ cơ chất chọn theo thắ nghiệm 2.2.3.3, tiến hành tự
phân ở nhiệt ựộ chọn từ thắ nghiệm 2.2.3.4 theo các mức thời gian ựã bố trắỄ, sau ựó ngừng phản ứng, ly tâm thu lấy dịch ựể phân tắch.
Kết quả thu nhận xác ựịnh : - Hàm lượng ựạm amine
- Hiệu suất thủy phân (phụ luc 1.8.3) - Hàm lượng ựạm ammoniac (phụ lục 1.9)
- Kiểm tra khối lượng phân tử sản phẩm tự phân bằng ựiện di trên gel SDS-PAGE (phụ lục 1.5).
Mẫu ựược chọn là mẫu cho kết quả hàm lượng ựạm amine cao nhưng hàm lượng ựạm ammoniac ở mức cho phép.
2.2.3.6 Khảo sát sự tương quan giữa nhiệt ựộ và thời gian tự phân
Việc xác ựịnh nhằm khảo sát sự tương quan ựồng thời giữa 2 nhân tố nhiệt ựộ và thời gian trong cùng ựiều kiện ựể so sánh với kết quả khảo sát từng nhân tố ở thắ nghiệm 2.2.3.4 và 2.2.3.5.
- Thắ nghiệm ựược bố trắ hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại: Nhân tố D: chọn 3 mức nhiệt ựộ cho hiệu suất thủy phân cao nhất (D1, D2, D3) Nhân tố E: chọn 3 mức thời gian cho hiệu suất thủy phân cao nhất (E1, E2, E3) Hai nhân tố trên ựược bố trắ theo phương pháp ma trận gồm 9 nghiệm thức. - Tổng số thắ nghiệm : 3 * 3 * 3 = 27
Tiến hành: Cân bột trùn quế vào các ống eppendorf, bổ sung loại dung dịch chọn từ thắ nghiệm 2.2.3.2 sao cho ựạt nồng ựộ cơ chất chọn theo thắ nghiệm 2.2.3.3, tiến hành tự phân theo các mức nhiệt ựộ và thời gian như ựã bố trắỄ, sau ựó ngừng phản ứng, ly tâm thu lấy dịch ựể phân tắch.
Kết quả thu nhận xác ựịnh: - Hàm lượng ựạm amine - Hiệu suất thủy phân
2.2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của chế ựộ sấy ựến chất lượng bột trùn quế tự phân
Tiến hành: Rửa sạch trùn quế, nghiền nhuyễn bằng cối xay, tiến hành tự phân theo các nhân tố ựã chọn từ các thắ nghiệm trên, ngừng phản ứng, ly tâm thu phần dịch và ựưa ựi sấy bằng 3 chế ựộ khác nhau:
- Sấy bằng máy sấy phun SD-05 (phụ lục hình 1.1)
- Sấy bằng luồng khắ nóng ở nhiệt ựộ 45ồC (phụ lục hình 1.2) - Sấy bằng luồng khắ nóng ở nhiệt ựộ 60ồC
Kết quả thu nhận xác ựịnh: - Hàm lượng ựạm tổng số - Hàm lượng ựạm amine - Hàm lượng ựạm ammoniac
- Phân tắch thành phần amino acid theo phương pháp sắc ký khắ (GC-EZ faast) và kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vi sinh mẫu ở chế ựộ sấy ựã chọn.
2.2.4 Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú ựể ựánh giá khả năng sử dụng sản phẩm bột trùn quế tự phân
Nuôi thử nghiệm ựể ựánh giá khả năng sử dụng sản phẩm bột trùn quế tự phân làm thức ăn cho ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú.
2.2.4.1 Phối chế thức ăn
Bột trùn quế chưa thủy phân và tự phân ựược phối chế với bột sữa, trứng và gluten ựể ựạt hàm lượng protein và lipid tương ựương với thức ăn Frippak 1 và Frippak 2, Frippak 150 ựồng thời bổ sung thêm vitamin, khoáng, chất kết dắnhẦ Việc thiết lập công thức thức ăn ựược thực hiện trên máy tắnh bằng chương trình Excel.
Quy trình chế biến thức ăn:
Cân nguyên liệu
Phối trộn nguyên liệu (khô)
Trộn ướt Ép viên Sấy Nghiền Rây Bảo quản
2.2.4.2 đánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân lên tỷ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng tôm sú sống và tăng trưởng của ấu trùng tôm sú
Chuẩn bị nước và hệ thống bể thắ nghiệm:
Nước ương ấu trùng có ựộ mặn 30Ẹ ựược pha từ nước máy và nước ót. Nước sau khi pha ựược xử lý bằng KMnO4 2 ppm. Khi nước trong thì ngừng sục khắ khoảng 24 giờ ựể các chất lơ lửng lắng xuống ựáy. Bơm lớp nước trong vào bể khác, xử lý lại bằng chlorine 30 ppm và sục khắ mạnh ựến khi hết chlorine trong nước, sau ựó lọc nước qua bể lọc cơ học.
Thắ nghiệm ựược tiến hành trên bể nhựa có thể tắch 120 lắt ựược bố trắ trong trại và có sục khắ liên tục (hình 1.3). Các bể ương ựược rửa sạch sau ựó khử trùng bằng chlorine nồng ựộ 200 - 400 ppm, rửa lại bằng nước ngọt, cấp nước có ựộ mặn 30Ẹ vào bể, xử lý EDTA. Sau khi xử lý 24 giờ thì bắt ựầu bố trắ ấu trùng.
Thắ nghiệm gồm có 3 nghiệm thức ựược bố trắ theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại:
- Nghiệm thức 2 (NT2): TACB từ bột trùn quế chưa thủy phân + Tảo tươi + Artemia - Nghiệm thức 3 (NT3): Thức ăn Frippak 1 (giai ựoạn Zoea) và Frippak 2 (giai ựoạn Mysis) + Tảo tươi + Artemia. Tổng số thắ nghiệm là : 3* 3 = 9
Bố trắ ấu trùng:
Nguồn Nauplius mua từ trại thực nghiệm Khoa Thủy sản, Trường đại học Cần Thơ. Trứng sau khi nở 32 - 36 giờ ựược bố trắ vào các bể nhựa có thể tắch 120 lắt bằng cách ựịnh lượng theo thể tắch với mật ựộ ương 150 Nauplius/lắt, tổng cộng bố trắ 15000 Nauplius/bể.
Chăm sóc và quản lý:
Khi ấu trùng Nauplius bắt ựầu chuyển sang Zoae-1 thì cho ăn tảo tươi 2 lần (cách 3 giờ cho ăn 1 lần), sau ựó chuyển sang cho ăn thức ăn chế biến 8 lần/ ngày ứng với mỗi nghiệm thức, cuối giai ựoạn Zoea-3 tiến hành siphon ựáy bể và cấp thêm nước vào. đến giai ựoạn Mysis cho ăn thức ăn chế biến 6 lần/ ngày (cách 3 giờ cho ăn 1 lần) và
Artemia bung dù 2 lần/ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi:
Các yếu tố môi trường theo dõi gồm:
- Nhiệt ựộ: ựo 2 lần/ngày vào lúc 8 giờ và 14 giờ bằng nhiệt kế - pH: ựo 2 lần/ngày lúc 8 giờ và 14 giờ bằng máy ựo pH
Các yếu tố sinh học theo dõi gồm:
- Chiều dài tổng ựược ựo ở các giai ựoạn Zoea-3, Mysis-2, Postlarvae-1 trên 30 mẫu bằng giấy kẻ ô ly.
- Tỷ lệ sống ựược xác ựịnh ở giai ựoạn Postlarvae-1 bằng cách thu toàn bộ và dùng phương pháp ựịnh lượng.
2.2.4.3 đánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân lên tỷ lệ sống, tăng trưởng và chất lượng của hậu ấu trùng tôm sú
Thắ nghiệm gồm có 3 nghiệm thức ựược bố trắ theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại:
- Nghiệm thức 1 (NT1): TACB từ bột trùn quế tự phân + Artemia
- Nghiệm thức 2 (NT2): TACB từ bột trùn quế chưa thủy phân + Artemia - Nghiệm thức 3 (NT3): Thức ăn Frippak 150 + Artemia
Tổng số thắ nghiệm là : 3* 3 = 9
Bố trắ hậu ấu trùng:
Nguồn Postlarvae-1 mua từ trại thực nghiệm Khoa Thủy sản, Trường đại học Cần Thơ. Bố trắ 2500 Postlarvae-1 vào mỗi bể nhựa có thể tắch 120 lắt chứa 50 lắt nước có ựộ mặn 30Ẹ.
Chăm sóc và quản lý:
Cho ăn TACB 6 lần/ngày (cách 3 giờ cho ăn 1 lần) ứng với mỗi nghiệm thức và Artemia
mới nở 2 lần/ngày. Siphon ựáy bể và thay nước 3 ngày/lần, mỗi lần thay 30 - 50%.
Các chỉ tiêu theo dõi:
Các yếu tố môi trường theo dõi gồm:
- Nhiệt ựộ và pH: giống như ở thắ nghiệm mục 2.2.4.2 Các yếu tố sinh học theo dõi gồm:
- Chiều dài tổng ựược ựo ở các giai ựoạn Postlarvae-5, Postlarvae-10 và Postlarvae-15 trên 30 mẫu bằng giấy kẻ ô ly.
- Tỷ lệ sống ựược xác ựịnh ở giai ựoạn Postlarvae-15 bằng cách thu toàn bộ và ựếm trực tiếp.
- đánh giá chất lượng tôm bột bằng phương pháp sốc formol nồng ựộ 150 ppm trong 30 phút.
2.3 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập ựược tắnh giá trị trung bình các lần lặp lại, ựộ lệch chuẩn. Tất cả các số liệu ựựơc xử lý trên excel và thống kê theo phần mềm Statgraphics Plus V. 3.0, so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phương pháp ANOVA.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ựến hoạt tắnh protease trùn quế tự phân 3.1.1 Thành phần nguyên liệu 3.1.1 Thành phần nguyên liệu
Trùn quế thu hoạch khoảng 8-9 tuần tuổi, ựược rửa sạch và loại bỏ chất cặn bã trong ựường tiêu hóa, tiến hành phân tắch các chỉ tiêu ựộ ẩm, xác ựịnh ựạm tổng số, hàm lượng protein, hoạt tắnh protease nhằm thấy ựược triển vọng ứng dụng hệ protease trùn quế trong y dược học và nuôi trồng thủy sản.
Bảng 3.1: Thành phần hóa học của trùn quế (tắnh theo % trọng lượng khô).
Chỉ tiêu phân tắch đơn vị Kết quả phân tắch
Hàm lượng Nitơ tổng số % 11,50
Hàm lượng protein tổng số % 71,86
Hàm lượng vật chất khô % 18,02
Hoạt ựộ riêng trên casein U/mg 0,021
Hoạt ựộ riêng trên ựĩa fibrin Plasmin U/mg 153,1
Kết qủa ở bảng 3.1 cho thấy trong nguyên liệu trùn quế có hệ enzyme protease hoạt ựộng khá mạnh trên cơ chất casein và ựặc biệt có khả năng thủy phân fibrin. Do ựó, việc nghiên cứu sâu enzyme này bằng các kỹ thuật sắc ký, ựiện di ựể tinh sạch và ứng dụng ựiều trị các bệnh về tim mạch là ựiều cần thiết.
Trùn quế có hàm lượng nước rất cao khoảng 81,98%, tuy vật chất khô chỉ có 18,02% nhưng hàm lượng protein tổng số chiếm ựến 71,86%. Vì vậy có thể xem ựây là nguồn protein ựể tiến hành thủy phân bằng chắnh hệ protease hoạt ựộng có sẵn trong trùn quế nhằm tạo ra sản phẩm giàu ựạm amine. điều này mở ra triển vọng mới trong việc khai thác nguồn lợi quý báu từ trùn quế làm thức ăn cho ấu trùng tôm và các loại cá con trong lĩnh vực thủy sản. Hiện nay ựã có một số nghiên cứu cho thấy khi tận dụng hệ enzyme có sẵn trong nguyên liệu ựể thực hiện quá trình tự phân cho hiệu suất thủy phân cao như
Nakajima Nobuyoshi và ctv. (2000) thủy phân trùn Lumbricus rubellus [85], Aspmo Stein Ivar và ctv. (2004) thủy phân nội tạng cá tuyết đại Tây Dương [51].
3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian tự phân lên hoạt tắnh protease trùn quế
Nhằm loại bớt các protein tạp có phân tử lượng cao, làm giảm ựộ nhớt dịch trùn quế trước khi tiến hành tinh sạch qua cột sắc ký, trùn quế ựược pha loãng với nước cất tự phân ở 45oC trong 4 giờ, sau ựó cho tự phân tiếp tục ở nhiệt ựộ phòng 15 ngày, mỗi ngày thu dịch thủy phân ựem ựo hoạt tắnh và xác ựịnh hàm lượng protein dịch enzyme. Kết quả phân tắch thể hiện trên hình 3.1
cho thấy dịch chiết trùn quế tươi với hoạt ựộ riêng trên cơ chất casein ban ựầu là 0,021 U/mg, sau quá trình tự phân giải 10 ngày có hoạt ựộ riêng ựạt cao nhất là 0,045 U/mg protein, tăng gấp 2 lần so với hoạt tắnh ban ựầu. Có khả năng quá trình tự phân giải giúp hoạt hóa các tiền chất của protease tương tự như sự hoạt hóa các enzyme trypsinogen hay
chymotrypsinogen trong hệ tiêu hóa của ựộng vật.
Ngoài ra chúng tôi nhận thấy trong quá trình tự phân giải ựộ nhớt của dịch thủy phân giảm nhiều nên ựã khắc phục ựược nhược ựiểm lớn theo Lý Thị Bắch Thủy và ctv (2006) là chất nhầy của trùn ựã ảnh hưởng rất lớn gây tắc cột và cản trở quá trình tách khi tinh sạch bằng các loại gel sắc ký [35]. đặc ựiểm tự phân này tương tự như loài trùn ựất
Lumbricus rubellus của Hàn Quốc và Nhật Bản [46], [45] .
3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt ựộ và pH lên hoạt tắnh protease trùn quế tự phân
Mỗi enzyme ựều có một nhiệt ựộ và pH hoạt ựộng tối ưu nhất ựịnh, vì vậy dịch enzyme tự phân ựược ủ ở các nhiệt ựộ khác nhau từ 30- 80ồC và khảo sát ở các giá trị pH từ 2-13 và xác ựịnh hoạt tắnh protease tại các thời ựiểm nhiệt ựộ và pH nói trên.
Hình 3.1 Hoạt ựộ riêng của protease trùn quế theo thời gian tự phân 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 1 4 7 10 13 Ngày H o ạ t ự ộ r iê n g ( U /m g p ro te in )
Kết quả thể hiện trên hình 3.3 cho thấy protease dịch trùn quế tự phân có khả năng hoạt ựộng ở nhiệt ựộ khá cao từ 50-60ồC, cao nhất ở 55ồC và pH kiềm mạnh 10-12. Qua ựó có thể xếp chúng vào loại protease kiềm và chịu nhiệt.
Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của protease trùn Lumbricus rubellus ở Hàn Quốc của Cho và ctv (2004a) [46] và Nhật Bản của Mihara và ctv. (1993) [82]. So với các enzyme có khả năng thủy phân fibrin có nguồn gốc từ nấm Flammulina velutipes [9] hoặc nấm ăn dùng trong y dược Cordyceps militaris [14] có nhiệt ựộ tối ưu thấp 30-37oC và pH 6-7 thì ựặc ựiểm này của trùn quế rất thuận lợi khi tiến hành tinh sạch vì theo Nakajima và ctv. (2000) enzyme từ các loài trùn ựất ựều bền với nhiệt và chịu ựược pH khá cao phù hợp với việc chọn dung dịch ựệm và sử dụng các loại gel trao ựổi ion mạnh.
3.1.4 Xác ựịnh ựiểm ựẳng ựiện protease trùn quế tự phân
Nhằm dự ựoán khả năng tắch ựiện hệ protease trùn quế ở môi trường pH nào ựó trước khi qua cột trao ựổi ion. Tủa protein thô ựược hòa tan với các pH khác nhau từ 2-13. Kết quả cho thấy ở pH từ 4-8 kết tủa nhận ựược nhiều hơn so với các pH khác và nhiều nhất tập trung ở pH 4-5. Hiện tượng này là do ở pH gần với pI ựiểm ựẳng ựiện các protein sẽ trung hòa về mặt ựiện tắch và có khuynh hướng ngưng kết với nhau tạo tủa. Kết tủa ựược thu hồi và kiểm tra hoạt ựộ tổng.
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy hoạt ựộ tổng thu ựược ở pH từ 4-8 khá cao so với các pH khác. Từ ựó có thể dự ựoán ựiểm ựẳng ựiện các protease trùn quế tự phân nằm trong khoảng pH <8. Dựa trên cơ sở ựó chọn gel trao ựổi ion âm ựể tinh sạch protein và mẫu
Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt ựộ, pH lên hoạt tắnh protease trùn quế
0 20 40 60 80 100 120 2 4 6 8 10 12 pH H o ạ t tắ n h t ư ơ n g q u a n ( % ) 0 20 40 60 80 100 30 40 50 60 70 80 Nhiệt ựộ oC H o ạ t tắ n h t ư ơ n g q u a n ( % )
ựược hòa tan trong dung dịch ựệm pH 8,5 nhằm mục ựắch ựưa phần lớn các protein có hoạt tắnh về ựiện tắch âm ựể chúng có thể ựược giữ lại trên gel.
Bảng 3.2. Hoat ựộ tổng ở các pH khác nhau sau khi thu hồi tủa.
pH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Hoạt tắnh (U)
0,043 0,265 0,935 0,961 0,813 0,754 0,719 0,664 0,644 0,454 0,249 0,165
3.1.5 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tắnh protease trùn quế tự phân
để hạn chế khả năng tự phân của các protease trùn quế trong suốt quá trình tinh sạch protein, cần bổ sung một số chất ức chế cần thiết trong dung dịch ựệm ựể trắch ly và tinh sạch enzyme. Qua khảo sát một số chất ức chế (hình 3.4) nhận thấy hầu hết không có chất nào có thể ức chế hoàn toàn ựược các protease trùn quế. Mức ựộ ức chế của các chất tăng dần theo thứ tự sau: PMSF> SBTI > Aprotinin > TPCK > TLCK trong ựó cao nhất là PMSF 73,21% và thấp nhất là TLCK 12,86%. Do PMSF có hiệu quả ức chế cao nhất nên chất này ựược bổ sung vào dung dịch ựệm trong quá trình tinh sạch protease tiếp theo.
3.2 Thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu các ựặc tắnh hóa học của hệ protease trùn quế tự phân