* Phá vỡ các mô mềm:
+ Máy nghiền ựơn giản, thiết bị ựồng hóa mẫu hoặc thiết bị nghiền mẫu potter.
* Phá vỡ các mô cứng : thường là các loại hạt, chúng ựược ngâm trong nước hoặc dung dịch ựệm. Sau ựó nghiền bằng cối xay hoặc cối chày thông thường. đôi khi cũng có thể nghiền trực tiếp trong nitơ lỏng.
* Vi khuẩn hoặc nấm men:
+ Phá vách tế bào bởi protease, dùng sóng siêu âm hoặc sử dụng áp suất [101].
1.3.1.3 Các yếu tố cần chú ý khi chiết tách protein
Dung dịch ựệm pH: pH có ảnh hưởng rất lớn ựến cấu trúc không gian của protein, vì thế nó cũng ảnh hưởng ựến chức năng sinh học của các phân tử này. Thông thường giá trị pH sử dụng sao cho protein có hoạt tắnh tối ựa. Tuy vậy ựó cũng chưa phải là giá trị pH
cho hiệu quả chiết tách tốt hoặc ổn ựịnh nhất. Vắ dụ trypsin hoạt ựộng tốt nhất ở pH 8-9 nhưng nó lại ổn ựịnh ở pH 3, vì tại giá trị pH này sự tự hủy có thể ựược tránh khỏi. Việc sử dụng pH khắc nghiệt ựôi lúc cũng rất hiệu quả và cũng ựược chấp nhận cho một vài trường hợp nếu như không gây biến tắnh protein. Hầu hết protein ựược hòa tan tốt ở lực ion vừa phải khoảng 0,05 Ờ 0,1M. Một dung dịch ựệm có khả năng chấp nhận ựược lấy trong phạm vi một ựơn vị pH từ giá trị pKa ựược cho [51].
Tác nhân khử
Hiệu thế khử của tế bào chất thường thấp hơn môi trường xung quanh nơi thường có mặt của oxy không khắ, những protein nội bào thường lộ ra những nhóm thiol và chúng có thể bị oxy hóa trong tiến trình tinh sạch. Những nhóm này ựược bảo vệ bởi các tác nhân khử như 1,4-dithioerythritol (DTE); 1,4-dithiothreitol (DTT) hoặc β-mercaptoethanol với nồng ựộ 10-25mM ựủ ựể bảo vệ nhóm thiol khỏi bị khử thành các cầu disulfit nội phân tử [51].
Ion kim loại Ờ phức càng cua (chelator)
Sự có mặt các ion kim loại nặng có thể gây bất lợi ựến hoạt tắnh sinh học protein. Chúng làm tăng sự oxy hóa nhóm thiol bởi các phân tử oxy, hoặc có thể tạo phức với các nhóm chuyên biệt và gây ra nhiều vấn ựề phức tạp. Kim loại nặng có thể kết hợp chặt chẽ với các tác nhân tạo phức càng cua, ựặc biệt là ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) nồng ựộ 10-25mM. Tuy nhiên cần chú ý EDTA cũng là một dung dịch ựệm, vì thế tốt nhất là thêm dạng muối có 2 natri trước khi ựiều chỉnh pH cuối cùng. Khả năng tạo phức càng cua sẽ gia tăng khi pH tăng. Một số protein ựược ổn ựịnh bởi các ion kim loại hóa trị 2 như Ca2+. Mg2+, nhưng chúng sẽ tạo phức càng cua với EDTA vì thế cần tránh sử dụng chung [51].
Chất ức chế sự phân giải protease
Một yếu tố thường ảnh hưởng ựến sự ổn ựịnh protein là sự phân giải bởi chắnh các protease có mặt trong môi trường chiết tách. Biện pháp an toàn nhất ựể giảm bớt sự phân giải protein là làm việc nhanh trong ựiều kiện lạnh, hoặc thêm các chất kìm hãm protease vào dung dịch ựệm chiết tách. đối với các protease thuộc nhóm serine và kim loại cần
bổ sung các chất kìm hãm ựể giảm bớt khả năng này. Tuy vậy, các chất kìm hãm protease thường rất ựắt, vì thế có thể giới hạn sử dụng trong việc áp dụng quy mô lớn [51].
Bảng 1.3 Các chất ức chế protease thông dụng
Chất ức chế protease Loại protease Nồng ựộ sử dụng PMSF
Aprotinin Benzamidin Pepstatin A Leupeptin EDTA & EGTA
Serine protease Serine protease Serine protease Acid protease Thiol protease Protease kim loại
0,1-1mM 5 ộg/ml 1mM 1ộg/ml 1 ộg/ml 0,1-1mM Chất kháng khuẩn
Tiến trình tinh sạch protein thường kéo dài, nên việc ựề phòng sự phát triển vi khuẩn trong dung dịch protein là ựiều cần thiết. Biện pháp ựơn giản nhất là sử dụng phễu lọc vô trùng (sterli-filtered), ựiều này sẽ giảm bớt sự phát triển vi khuẩn trong cột sắc ký. Một cách khác nữa là tạo một dòng chảy tốc ựộ rất thấp liên tục qua cột ngay cả khi không sử dụng. Dung dịch ựệm ở pH trung tắnh thường thắch hợp cho sự phát triển vi khuẩn, vì thế ở pH ựệm ≤ 3 và pH ≥ 9 có thể ngăn chặn ựược ựiều này nhưng ựôi lúc cũng dẫn ựến sự phát triển của nấm mốc. điều kiện cho phép có thể sử dụng tác nhân kháng khuẩn vào dung dịch ựệm, thường sử dụng nhất là hợp chất azide 0,01mM, merthiolate 0,05% hoặc alcol n-butanol 1%. Hạn chế ựối với hợp chất azide là có khả năng gắn với kim loại, nên sẽ ảnh hưởng ựến việc ựo hoạt tắnh và tiến trình chạy sắc ký, tuy vậy nó vẫn thường ựược thêm vào ựể bảo quản dung dịch protein [71].
Ngoài ra, trong trường hợp chiết tách protein màng, các nhóm kỵ nước thường gắn chặt vào màng tế bào và kết tụ thành khu kỵ nước. Vì vậy cần phải sử dụng các chất tẩy rửa hoặc tác nhân tạo phức càng cua ựể tách các nhóm kỵ nước ra khỏi màng tế bào. Một vài chất không gây biến tắnh các protein hình cầu hoặc không ảnh hưởng ựến hoạt tắnh sinh học nhưng một số chất khác có thể gây biến tắnh như SDS. Thông thường chỉ sử dụng chất tẩy rửa cùng với dung dịch ựệm ở giai ựoạn chiết tách ựầu tiên và không nên sử dụng ở nồng ựộ cao sẽ ảnh hưởng ựến các tiến trình tinh sạch và phân tắch sau này.