lên hoạt tắnh protease trùn quế tự phân
Xác ựịnh nhiệt ựộ và pH tối ưu, pI, chất ức chế của enzyme protease nhằm chọn loại gel và dung dịch ựệm thắch hợp ựể chuẩn bị tinh sạch hệ protease trong trùn quế.
Tủa protein thu ựược từ thắ nghiệm 2.2.1.3, hòa tan trong ựệm 50 mM phosphate pH 7,5, xác ựịnh hàm lượng protein và tiến hành khảo sát các yếu tố sau:
+ Nhiệt ựộ tối ưu ựược khảo sát ở các nhiệt ựộ khác nhau 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80ồC trong 10 phút. Xác ựịnh hoạt tắnh protease tại các nhiệt ựộ trên. Hoạt tắnh tương quan ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme hoạt ựộng ở nhiệt ựộ tối ưu.
+ pH tối ưu của dịch trùn quế ựược khảo sát ở các giá trị pH khác nhau từ 2-13. Enzyme ựược ủ ở các pH trong 30 phút và ựo hoạt tắnh protease theo phương pháp Anson cải tiến. Hoạt tắnh tương quan ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme hoạt ựộng ở pH tối ưu. + Xác ựịnh ựiểm ựẳng ựiện các protease dịch trùn quế [9]: tiến hành thắ nghiệm dựa trên khả năng tủa nhanh chóng tại các pH khác nhau từ 2-13 khi thêm tác nhân tủa alcol 96o (1ml). Thu hồi tủa xác ựịnh hoạt ựộ tổng ựược thực hiện trên cơ chất casein theo phương pháp Anson cải tiến.
+ Khảo sát ảnh hưởng 5 chất ức chế lên hoạt tắnh protease của dịch trùn quế thô : phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) 1mM, N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl keton (TPCK) 0,1mM, N-torsyl-L-lysine chloromethyl keton (TLCK) 0,1mM, aprotinin 2ộg/ml, soybean trypsin inhibitor (SBTI) 0,01mM, sau ựó xác ựịnh hoạt tắnh protease theo phương pháp Anson cải tiến. Hoạt tắnh tương quan ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme hoạt ựộng ở mẫu enzyme không có chất ức chế.
2.2.2 Thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu các ựặc tắnh hóa học của hệ protease trùn quế tự phân quế tự phân
Việc thu nhận bằng các tác nhân tủa nhằm loại bỏ protein không có hoạt tắnh protease
+ Tủa aceton với các tỷ lệ dịch trùn quế và aceton (v/v) lần lượt là : 1:0,5; 1:1; 1:1,5 ; 1:2 ; 1:2,5 và 1:3
Sau ựó ựem ly tâm ở 10.000 ở 4oC, 30 phút. Thu lấy phần cặn, làm khô trong bình hút ẩm chân không. Tiến hành xác ựịnh hàm lượng protein và ựo hoạt tắnh theo Anson cải tiến các mẫu tủa với tỷ lệ aceton khác nhau.
+ Tủa phân ựoạn ammonium sulfate 20-90% bão hòa.
Tắnh tóan dịch trùn quế tự phân và muối (NH4)2SO4 cho vào ựể ựạt các nồng ựộ 0-20; 30; 40; 50; 60; 70; 80 và 90% bão hòa. Thu hồi tủa các phân ựoạn bằng cách ly tâm 10.000g ở 4oC, 30 phút. Thẩm tắch loại muối và tiến hành xác ựịnh hàm lượng protein và ựo hoạt tắnh theo Anson cải tiến từng phân ựoạn.
So sánh kết quả với tủa aceton ựể chọn phương pháp tủa sơ bộ tốt nhất, tiếp tục tiến hành các bước khảo sát sơ bộ một số tắnh chất protease của trùn quế và tinh sạch.
2.2.2.2 Tinh sạch protease trùn quế bằng kỹ thuật sắc ký, ựiện di
Nhằm tìm ra loại gel và trình tự các bước sắc ký ựể tinh sạch các protease trong trùn quế.
Khảo sát chọn gel trao ựổi ion âm
Dựa vào khoảng pI từ thắ nghiệm khảo sát sơ bộ tiến hành hòa tan tủa protein trong ựệm 20mM Tris-HCl pH 8,5 + 1mM PMSF. Sau ựó cho dịch enzyme thô lần lượt lên cột chứa gel DEAE và Unosphere Q với tốc ựộ dòng 0,8ml/phút. Thu nhận protein không hấp phụ trên gel qua cột. Sau ựó giải hấp phụ protein bị giữ trên gel bằng gradient nồng ựộ muối 0-0,45 M NaCl, tốc ựộ dòng 1 ml/phút. Kiểm tra hoạt tắnh protease phần protein không hấp phụ và các phân ựoạn protein thu nhận ựược sau khi giải hấp phụ.
Sắc ký trao ựổi ion trên cột Unosphere Q
10 g protein thô hòa tan trong 100 ml ựệm 20 mM Tris-HCl pH 8,5 + 1 mM PMSF. Cột sắc ký 1,5 x 40 cm ựược nhồi gel Unosphere Q, cân bằng với ựệm 20 mM Tris-HCl pH 8,5 + 1 M PMSF. Dung dịch protein ựược cho qua cột với tốc ựộ dòng 0,8 ml/phút. Protein hấp phụ ựược rửa bằng gradient nồng ựộ muối 0-0,045 M NaCl, tốc ựộ dòng 1
ml/phút. Thu các phân ựoạn protein, xác ựịnh hàm lượng protein, xác ựịnh hoạt tắnh protease trên casein theo phương pháp Anson cải tiến và chạy ựiện di trên gel polyacrylamide có SDS và chất khử β-mercaptoethanol mỗi giếng khoảng 20ộg protein.
Sắc ký tương tác kỵ nước trên cột phenyl sepharose
Các phân ựoạn protease có hoạt tắnh thu nhận ựược sau khi qua cột sắc ký trao ựổi ion, tiếp tục cho qua cột sắc ký tương tác kỵ nước. Cột (1,5 x 30 cm) ựược nhồi gel Phenyl Sepharose. Cân bằng cột với ựệm 20 mM Tris-HCl pH 8,5 + 1 mM PMSF + 13% ammonium sulphate (AS) tốc ựộ dòng 1,0 ml/phút. Các phân ựoạn ựược tuần tự cho qua cột. Protein hấp phụ ựược rửa với gradient nồng ựộ muối 30-0% ammonium sulphate, tốc ựộ dòng 1 ml/phút. Thu các phân ựoạn protein, xác ựịnh hàm lượng protein, xác ựịnh hoạt tắnh protease trên casein theo phương pháp Anson cải tiến và chạy ựiện di trên gel polyacrylamide có SDS và chất khử β-mercaptoethanol mỗi giếng khoảng 20ộg protein.
Sắc ký lọc gel trên cột Superose 12
Các phân ựoạn có hoạt tắnh protease thu ựược từ sắc ký tương tác kỵ nước ựược thẩm tắch loại muối trong ựệm 20 mM Tris-HCl pH 7,5 + 10 mM PMSF. Từng phân ựoạn ựược cho tuần tự qua cột lọc gel Superose 12 (Amersham), sử dụng hệ thống sắc ký tự ựộng Biologic HR (Bio-Rad) với cùng dung dịch ựệm, tốc ựộ dòng chảy 0,5 ml/phút. Protein sau khi giải hấp phụ ựược thu lại, xác ựịnh hàm lượng protein, hoạt tắnh protease trên casein và ựiện di SDS-PAGE mỗi giếng khoảng 20ộg protein.
Các phân ựoạn enzyme sau khi tinh sạch ựược thẩm tắch loại muối và ựông khô lạnh bằng thiết bị VirTis (Mỹ).
điện di
Kỹ thuật SDS-PAGE theo Hames (1998) với gel polyacrylamide 12% (Phụ luc 1.5) [54]. Xác ựịnh khối lượng phân tử của protein dựa trên thang protein chuẩn của Fermentas gồm : lysozyme (14,4kDa) ; β-lactoglobulin (18,4kDa); restriction
endonuclease Bsp 98I (25kDa); lactate dehydrogenase (35kDa); ovalbumin (45kDa); bovin serum albumin (66,2kDa); β-galactoside (116kDa).
Khối lượng phân tử một protein ựược tắnh từ ựường chuẩn bằng cách lấy log Mr với hệ số Rf của các protein chuẩn.
2.2.2.3 Khảo sát ựặc tắnh hóa học các protease sau khi tinh sạch
Xác ựịnh cơ chất và chất ức chế ựặc hiệu nhằm có thể phân loại nhóm protease, khảo sát các ựiều kiện nhiệt ựộ và pH tối ưu, pI và ựộ bền theo thời gian của từng loại protease tinh sạch ựược.
Khảo sát hoạt tắnh thủy phân các phân ựoạn protein sau khi tinh sạch trên các cơ chất khác nhau
+ Hoạt tắnh thủy phân protease trên cơ chất casein và ựĩa fibrin ựã trình bày ở phần 2.2.1.1.
+ Hoạt tắnh thủy phân trên cơ chất tổng hợp Nα-benzoyl-arginine p-nitroanilide; Nα- benzoyl-tyrosine p-nitroanilide [108]. Mỗi cơ chất ựược pha trong 50mM Tris-HCl, pH 7,4 có nồng ựộ 0,2mM phản ứng với 10ộl enzyme. Sau khi ủ ở 37oC trong 10 phút, phản ứng kết thúc bằng cách thêm 2ml acetic acid 50% và sản phẩm p-nitroaniline giải phóng ựựơc ựo ở ựộ hấp thu 490nm. Một ựơn vị hoạt tắnh enzyme ựược xác ựịnh là lượng enzyme cần thiết ựể giải phóng 1ộmol p-nitroaniline trong một phút dưới các ựiều kiện trên và biểu hiện qua ựơn vị U/mg protein.
Ảnh hưởng chất ức chế lên hoạt tắnh protease
Các phân ựoạn enzyme tinh sạch ựược pha trong ựệm 50 mM phosphate pH 7,5 xác ựịnh hàm lượng protein và ủ trong 10 phút ở 37oC với 8 chất ức chế : phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF), N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl keton (TPCK), aprotinin, leupeptin, soybean trypsin inhibitor (SBTI), ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA), chymostatin, peptastatin với nồng ựộ gốc từ 0,01-1 mM, sau ựó xác ựịnh hoạt tắnh protease theo phương pháp Anson cải tiến. Hoạt tắnh tương quan ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme hoạt ựộng ở mẫu enzyme không có chất ức chế.
Xác ựịnh nhiệt ựộ tối ưu và ựộ bền nhiệt của các protease
+ Xác ựịnh nhiệt ựộ tối ưu: Các phân ựoạn enzyme tinh sạch ựược hòa tan trong ựệm 50 mM phosphate pH 7,5, xác ựịnh hàm lượng protein và ủ ở các nhiệt ựộ khác nhau 30,
37, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 và 80ồC trong 10 phút. Xác ựịnh hoạt tắnh protease tại các nhiệt ựộ trên. Hoạt tắnh tương quan trong thắ nghiệm ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme ở nhiệt ựộ tối ưu.
+ Xác ựịnh ựộ bền nhiệt của các protease: Các phân ựoạn enzyme tinh sạch xác ựịnh hàm lượng protein, ựược ủ ở các nhiệt ựộ 37, 50, 55, 60, 65, 70oC trong 3 giờ. Sau ựó ổn ựịnh ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút, ựo hoạt tắnh bằng phương pháp Anson cải tiến. Hoạt tắnh tương quan % trong thắ nghiệm ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme hoạt ựộng ở 37oC.
Xác ựịnh pH tối ưu và ựộ bền pH của các protease
+ Xác ựịnh pH tối ưu : pH tối ưu của các phân ựoạn protease sau khi tinh sạch ựược khảo sát ở các giá trị pH khác nhau từ 2-13. Enzyme ựược ủ ở các pH trong 30 phút và ựo hoạt tắnh protease ở các pH trên. Hoạt tắnh tương quan ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme ở pH tối ưu.
+ Xác ựịnh ựộ bền pH : Các phân ựoạn enzyme ựược ủ ở pH từ 2-13 trong 16 giờ ở 4ồC. Sau ựó dung dịch enzyme ựược ựưa về pH 7, xác ựịnh hoạt tắnh bằng phương pháp Anson cải tiến. Hoạt tắnh tương quan trong thắ nghiệm ựược so sánh với hoạt tắnh enzyme hoạt ựộng ở pH 7.
Xác ựịnh ựộ bền enzyme theo thời gian
Các phân ựoạn enzyme ựược pha trong hai dung môi nước và ựệm 50mM phosphate pH 7,5 chứa NaN3 0,1% với nồng ựộ 1mg/ml, hàn kắn miệng ựể tránh sự bay hơi dung môi, bảo quản ở 4oC.
Kiểm tra hoạt tắnh enzyme còn lại một lần mỗi tháng trong thời gian 10 tháng. Hoạt tắnh tương quan ựược so sánh với hoạt tắnh tại thời ựiểm ựầu tiên của từng phân ựoạn.
Kiểm tra hoạt tắnh thủy phân fibrinogen bằng kỹ thuật SDS-PAGE [111]:
Hỗn hợp 10 ộl dung dịch các phân ựoạn enzyme tinh sạch (1mg/ml) và 450ộl bovine fibrinogen (1mg/ml) ựược ủ ở 37ồC. Dịch thủy phân ựược lấy ở các thời ựiểm 10, 20,
30, 60, 90, 120, 180, 240 và 480 phút. Sau ựó ngừng phản ứng, ựem ựun ở 100ồC. Sau ựó mỗi mẫu lấy 20ộg protein ựem chạy ựiện di SDS với gel polyacrylamide 12%.
Xác ựịnh ựiểm ựẳng ựiện các protease sau tinh sạch bằng ựiện di hai chiều
- Quy trình xử lý mẫu enzyme sau khi tinh sạch theo kắt 2D-Cleanup Kit (Bio-Rad)
(xem phụ lục 1.6.1)
- điện di chiều thứ nhất IEF (Isoelectric Focusing)
+ Sử dụng các thanh ựiện di IPG (IPG Strip, Bio-Rad) có gradient pH từ 3-10. + Kỹ thuật ựiện di (xem phụ lục 1.6.2)
- điện di chiều thứ hai SDS-PAGE
+ đổ gel phân tắch polyacrylamide 12% ựể chạy chiều thứ hai và không cần gel tập trung (xem phụ lục 1.6.2)
+ Lượng mẫu ựưa vào khoảng 10ộg protein
Phân tắch các protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật MALDI-TOF-TOF
Việc phân tắch này ựể so sánh trình tự amino acid các ựoạn peptide ựược tách ra sau quá trình thủy phân các protease tinh sạch từ trùn quế bởi trypsin với trình tự các amino acid ựã công bố trên ngân hàng dữ liệu trình tự protein không giới hạn NRDBnhằm ựánh gắa sự tương ựồng với những protease từ các loài trùn ựất và một số loài khác.
Các mẫu enzyme FI-a, FI-b, FII, FIII-1, FIII-2, FIV sau khi chạy ựiện di hai chiều cắt ựiểm protein trên gel. Riêng FIII-3 do sự tự phân quá mạnh mặc dù có xử lý chất ức chế nhưng vẫn không thể chạy ựiện di hai chiều nên chúng tôi cắt phân ựoạn này ở 2 ựiểm trên gel ựiện di một chiều. Tiến hành xử lý mẫu, thủy phân bằng trypsin và làm khô ựược tiến hành tại Phòng thắ nghiệm Enzyme (đại Học Cần Thơ) theo protocol của trung tâm protein và proteomic đại Học Singapor. (phụ lục 1.7.1). Sau ựó mẫu trữ lạnh - 20oC. Mẫu tiếp tục phân tắch bằng kỹ thuật khối phổ MALDI-TOF-TOF
Các peptide sau khi thủy phân ựược phân tắch tại trung tâm proteomic đại Học Quốc gia Singapor
Tủa protein Trùn quế ( Perionyx excavatus) Tự thủy phân Khảo sát sơ bộ (pH, nhiệt ựộ, chất ức chế protease)
Sắc ký trao ựổi ion âm trên gel Unosphere Q
Tương tác kỵ nước trên gel Phenyl Sepharose
Lọc gel Superose 12
SDS-PAGE
Khảo sát ựặc ựiểm các protease sau tinh sạch
Thử hoạt tắnh các cơ chất khác nhau
Ảnh hưởng chất ức chế,
pH, To, ựộ bền enzyme 2-D ựiện di, phân tắch thành phần peptide
2.2.3 Khảo sát các ựiều kiện tối ưu ựể thu nhận bột trùn quế tự phân
Xác ựịnh các ựiều kiện thắch hợp ựể quá trình tự phân ựạt hiệu suất cao nhất và tìm chế ựộ sấy thắch hợp cho sản phẩm tự phân trùn quế.
2.2.3.1 Xác ựịnh pH thắch hợp cho quá trình tự phân.
- Thắ nghiệm ựược bố trắ hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố A: pH của môi trường tự phân với 8 mức ựộ
A1 = 6 A4 = 9 A7 = 12
A2 = 7 A5 = 10 A8 = 13
A3 = 8 A6 = 11
- Tổng số thắ nghiệm là: 8 * 3 = 24
Tiến hành: Cân bột trùn quế vào các ống eppendorf, bổ sung dung dịch ựệm theo các pH ựã bố trắ sao cho ựạt nồng ựộ cơ chất ựạt hàm lượng protein 8%, tiến hành tự phân trong 5 giờ ở nhiệt ựộ 50ồC sau ựó ngừng phản ứng bằng cách ựun sôi dịch tự phân trong 30 phút, ly tâm thu lấy dịch ựể phân tắch.
2.2.3.2 Xác ựịnh dung dịch thắch hợp bổ sung cho quá trình tự phân.
- Thắ nghiệm ựược bố trắ hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố B: Loại dung dịch tự phân: có 2 loại:
B1 = nước cất
B2 = dung dịch ựệm pH chọn từ thắ nghiệm 2.2.3.1 - Tổng số thắ nghiệm là: 2 * 3 = 6
Tiến hành: Cân bột trùn quế vào các ống eppendorf, bổ sung nước cất hoặc dung dịch ựệm pH chọn từ thắ nghiệm 1 sao cho ựạt nồng ựộ protein 8%, tiến hành tự phân trong 5 giờ ở nhiệt ựộ 50ồC sau ựó ngừng phản ứng, ly tâm thu lấy dịch ựể phân tắch.
2.2.3.3 Khảo sát tỷ lệ pha loãng thắch hợp cho qúa trình tự phân trùn quế
- Thắ nghiệm ựược bố trắ hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại
Nhân tố C: Tỷ lệ trùn quế và nước cất sao cho hàm lượng protein dịch tự phân (tắnh trên %vật chất khô (w/w)) ựạt 9 mức ựộ :
C2 = 4% C5 = 7% C8 = 10%
C3 = 5% C6 = 8% C9 = 11%
- Tổng số thắ nghiệm là: 9 * 3 = 27
Tiến hành: Cân bột trùn quế vào các ống eppendorf, bổ sung loại dung dịch chọn từ thắ nghiệm 2.2.3.2 sao cho ựạt nồng ựộ cơ chất theo các nghiệm thức ựã bố trắ, tiến hành tự phân trong 24 giờ ở nhiệt ựộ 50ồC sau ựó ngừng phản ứng, ly tâm thu lấy dịch ựể phân tắch.
2.2.3.4 Xác ựịnh nhiệt ựộ thắch hợp cho quá trình tự phân
- Thắ nghiệm ựược bố trắ hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố D: nhiệt ựộ của môi trường tự phân trùn quế với 7 mức ựộ:
D1 = 40ỨC D2 = 45ỨC D3 = 50ỨC D4 = 55ỨC D5 = 60ỨC D6 = 65ỨC D5 = 70ỨC
- Tổng số thắ nghiệm là: 7 * 3 = 21
Tiến hành: Cân bột trùn quế vào các ống eppendorf, bổ sung loại dung dịch chọn từ thắ nghiệm 2.2.3.2 sao cho ựạt nồng ựộ cơ chất chọn từ thắ nghiệm 2.2.3.3, tiến hành tự phân trong 24 giờ ở các mức nhiệt ựộ ựã bố trắ, sau ựó ngừng phản ứng, ly tâm thu lấy dịch ựể phân tắch.
Các thắ nghiệm từ 2.2.3.1 ựến 2.2.3.4 ựem phân tắch hàm lượng ựạm amine theo phương pháp OPA (phụ lục 1.8) và tắnh hiệu suất thủy phân. Mẫu ựược chọn là mẫu cho kết quả cao nhất.
2.2.3.5 Xác ựịnh thời gian tự phân thắch hợp
- Thắ nghiệm ựược bố trắ hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại