Nếu protein có cùng khối lượng phân tử sau khi tinh sạch ựược tách ra trên gel SDS- PAGE nhưng sự tắch ựiện của chúng có thể khác nhau và sẽ ựược tách tiếp tục ở ựiện di ựiểm ựẳng ựiện thì chúng ựược xem là ựồng ựẳng của nhau. đối với enzyme gọi là isozyme. Trong trường hợp này cần kiểm tra ựể xác ựịnh tiếp tục pI của protein bằng ựiện di ựiểm ựẳng ựiện hoặc ựiện di hai chiều.
điện di hai chiều là phương pháp tách protein hoặc acid nucleic trong mẫu phân tắch thành các ựiểm theo hai hướng khác nhau trong cùng một gel [116]. Nó là sự kết hợp của kỹ thuật ựiện di ựiểm ựẳng ựiện và ựiện di xác ựịnh khối lượng phân tử SDS-PAGE. Cả hai kỹ thuật này ựều phụ thuộc vào những tắnh chất hóa lý của protein như khả năng tắch ựịên và khối lượng phân tử. Ưu ựiểm của kỹ thuật này là hàm lượng protein phân tắch rất nhỏ (vài nanogam), có thể phân tắch hỗn hợp khoảng 1800 protein khác nhau trong cùng một gel [116] và là công cụ ựầu tiên trong phân tắch protein. Nhược ựiểm của phương pháp ựiện di hai chiều là việc xử lý mẫu, vì khó có thể tách một hỗn hợp protein phức tạp với nhiều các ựặc tắnh khác nhau.
Trong ựiện di hai chiều, ựiện di ựiểm ựẳng ựiện sẽ ựược chạy bước ựầu tiên, sau ựó mới chạy ựiện di SDS-PAGE sau. điện di ựiểm ựẳng ựiện (IEF) dựa trên cơ sở tách protein theo ựiểm ựẳng ựiện của nó. Mỗi phân tử protein ựều là các phân tử lưỡng tắnh, khả năng tắch ựiện của chúng phụ thuộc vào pH môi trường. Tại ựiểm ựẳng ựiện pI protein không tắch ựiện và không di chuyển trong ựiện trường.
Thông thường gel ựiện di IEF chứa gradient pH ựược làm từ các phân tử lưỡng tắnh (ampholite) như các amino acid hoặc dẫn suất của acrylamide CH2=CH-CO-NH-R với các gốc R có chứa nhóm carboxyl và nhóm amine bậc ba. Các ampholite sẽ tạo một gradient pH từ thấp ựến cao trên gel. Ở môi trường pH > pI protein sẽ tắch ựiện âm và pH < pI protein sẽ tắch ựiện dương. Trong ựiện trường IEF, các protein tùy thuộc vào sự tắch ựiện sẽ dịch chuyển về cực âm hay dương và ở giá trị pH = pI thì protein sẽ ựược dừng lại.