PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC

Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400,000 loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài, vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Ta có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo các khái niệm cơ bản như sau: • Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ chằng chịt phát triển rất nhanh gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm. • Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, phát triển thành các khuẩn lạc tròn, lồi viền đều, bóng hoặc mờ trên bề mặt môi trường thạch nấm. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm nếu có thể sinh trưởng và phát triển của nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực phẩm, một số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. • Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từ môi trường. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 280C, một số ít trong nhóm này ưa lạnh hay ưa nóng. Nước hoạt tính cũng là một nhân tố ảnh hưởng rất quan trọng đến tăng trưởng. Hầu hết các loài nấm men nấm mốc và nấm men phát triển tốt trong cơ chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lớn hơn, một số ít loài có thể tăng trưởng trong cơ chất có nước hoạt tính thấp hơn khoảng 60 – 70%. Nấm mốc và nấm men tăng trưởng được trong vùng pH từ 2 9, trong đó pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Một số loài có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng, nhưng dù ở dạng nào, oxy vẫn là nguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm mốc và nấm men. Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trãi hộp và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran 18% Glycerol Agar (DG 18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). Môi trường DRBC được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0.95 như thịt, trứng, các sản phẩm sữa ( trừ sữa bột ) rau quả, các loại pate tươi… Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0.95 như quả khô, bánh ngọt, mứt, thịt khô, cá muối, ngũ cốc, đậu đỗ và các sản phẩm đậu đỗ, bột mì, quả hạch, gia vị…

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠỊ HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI TIỂU LUẬN MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM TÊN ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Nhóm: 2, thứ 3, tiết 1-2, phòng B202 SVTH: Thái Thị Mộng Liễu - 2006140154 cúc - 2006140062 Bùi Thị Thu Sen - 2005140474 tuyền -3005150008 TP Hồ Chí Minh,ngày 27 tháng 09 năm 2016 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠỊ HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI TIỂU LUẬN MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM TÊN ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Nhóm: 2, thứ 3, tiết 1-2, phòng B202 SVTH: Thái Thị Mộng Liễu - 2006140154 cúc - 2006140062 Bùi Thị Thu Sen - 2005140474 tuyền -3005150008 TP Hồ Chí Minh,ngày 27 tháng 09 năm 2016 Danh sách nhóm ST T Họ Và tên Nguyễn Thị Thanh Tuyền MSSV 2006140386 Phân Công Tổng hợp Word Mục lục ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN-NẤM MỐC Tổng quan nấm men nấm mốc Nấm men nấm mốc nhóm vi sinh vật đa dạng, có 400,000 loài nấm men nấm mốc mô tả Đây nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào lớp vỏ chitin, có nhân bào quan khác Tất loài nấm men nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung cấp lượng từ môi trường bên ngoài, vi sinh vật thường xuyên phân lập từ thực phẩm hay nguồn giàu dinh dưỡng khác Ta phân biệt nấm men nấm mốc theo khái niệm sau: • Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành hệ chằng chịt phát triển • nhanh gọi khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm Nấm men tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi viền đều, bóng mờ bề mặt môi trường thạch nấm Đơn vị hình thành khuẩn lạc nấm mốc nấm men mầm để tạo nên khuẩn lạc nuôi cấy môi trường Mầm bào tử, tế bào hay đoạn khuẩn ty Trong thực phẩm sinh trưởng phát triển nấm men, nấm mốc làm thay đổi màu thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc thực phẩm, số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm • Quá trình tăng trưởng nấm men nấm mốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố từ môi trường Hầu hết nấm mốc, nấm men thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho phát triển chúng khoảng 20 – 28 0C, số nhóm ưa lạnh hay ưa nóng Nước hoạt tính cũng nhân tố ảnh hưởng quan trọng đến tăng trưởng Hầu hết loài nấm men nấm mốc nấm men phát triển tốt chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lớn hơn, số loài tăng trưởng chất có nước hoạt tính thấp khoảng 60 – 70% Nấm mốc nấm men tăng trưởng vùng pH từ - 9, pH thích hợp nằm khoảng – 6,5 Hầu hết nấm mốc, nấm men thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, số phát triển điều kiện vi hiếu khí Một số loài tiếp nhận oxy nguyên tử từ chất chúng, dù dạng nào, oxy vẫn nguyên tố cần thiết cho trình phát triển nấm mốc nấm men Mật độ nấm men nấm mốc mẫu xác định chung dạng tổng nấm men nấm mốc kỹ thuật pha loãng, trãi hộp đếm khuẩn lạc môi trường Dichloran 18% Glycerol Agar (DG 18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) Môi trường DRBC sử dụng cho loại mẫu thực phẩm thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn 0.95 thịt, trứng, sản phẩm sữa ( trừ sữa bột ) rau quả, loại pate tươi… Môi trường DG18 sử dụng cho loại mẫu thực phẩm thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước nhỏ 0.95 khô, bánh ngọt, mứt, thịt khô, cá muối, ngũ cốc, đậu đỗ sản phẩm đậu đỗ, bột mì, hạch, gia vị… Trong thực phẩm, có diện mốc men, chúng phát triển làm thay đổi màu thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc thực phẩm, số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm Phương pháp định lượng tổng nấm men nấm mốc 2.1 Phương pháp 1: Phương pháp truyền thống 2.1.1 Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo TCVN 8275-1,2:2012 (ISO 21527-1,2:2008) dùng để định lượng nấm men nấm mốc sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn 0.95% hoạt độ nước nhỏ 0.95% 2.1.2 Nguyên tắc Chuẩn bị đĩa nuôi cấy bề mặt, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc qui định Tùy chọn vào số lượng khuẩn lạc dự kiến, sử dụng lượng xác định mẫu (nếu sản phẩm dạng lỏng) huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm dạng khác), dung dịch pha loãng thập phân mẫu/huyền phù Có thể chuẩn bị đĩa bổ sung điều kiện, sử dụng dung dịch thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu Ủ đĩa cấy điều kiện hiếu khí 25⁰C ± 10C ngày Các đĩa thạch để ánh sáng khuếch tán từ ngày đến ngày, cần Đếm khuẩn lạc/các chồi, khẳng định việc nhận dạng khuẩn lạc nghi ngờ kính phóng đại kính hiển vi (để phân biệt khuẩn lạc nấm men với khuẩn lạc vi khuẩn), cần Số lượng nấm men nấm mốc gam mililit mẫu tính từ số lượng khuẩn lạc/chồi/mầm thu đĩa chọn mức pha loãng tạo khuẩn lạc đếm Nấm men nấm mốc đếm riêng, cần Xác định số lượng nấm men nấm mốc mẫu kỹ thuật pha loãng đổ đĩa, khối lượng mẫu xác định cấy trang môi trường DG18 ( Dichloran Glycerol Agar ) hay DRBC ( Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ) Sau ủ 250C 5-7 ngày, đếm số khuẩn lạc nấm men nấm mốc riêng biệt 2.1.3 Môi trường hóa chất Môi trường – Hóa chất Mục đích Saline Pepton Water (SPW) Pha loãng mẫu DG18 Nuôi cấy nấm men nấm mốc DRBC HCl 10% Chỉnh pH NaOH 10% Bảng Môi trường hóa chất 2.1.3.1 Dịch pha loãng 2.1.3.1.1 Yêu cầu chung Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (tất phần), TCVN 6263 (ISO 8261) tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm CHÚ THÍCH: bổ sung tác nhân hoạt động bề mặt natri poly (oxyetylen) sorbatitanmonooleat [0,05 % nồng độ khối lượng] vào dịch pha loãng để giảm màng bào tử nấm mốc bào tử dính Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng) làm dịch pha loãng, trừ để chuẩn bị mẫu thử cụ thể 2.1.3.1.2 Thành phần canh thang nước pepton 0,1 % (nồng độ khối lượng) Dịch thủy phân mô động vật thực vật enzym 1,0 g Nước 1000 ml Dịch thủy phân mô động vật thực vật enzyme (1,0g) hàm lượng để vi sinh vật phát triển không nhằm mục đích tăng sinh 2.1.3.1.3 Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng) Hòa tan thành phần nước, đun nóng cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,2 250C, cần 2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy 2.1.3.2.1 Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC) Thành phần Sản phẩm thủy phân mô động vật thực vật enzyme 5,0 g D-Glucoza (C6H12O6) 10,0 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,0 g Magie sulfat (MgSO4.H2O) 0,5 g Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin) 0,002 g Rose Bengal 0,025 g Thạch từ 12 g đến 15 ga Chloramphenicol Nước cất nước loại ion 0,1 g 000 ml 2.1.3.2.2 Thạch dicloran glycerol 18% (nồng đồ khối lượng) (DG18) Thành phần Sản phẩm thủy phân casein enzym 5,0 g D-Glucoza (C6H12O6) 10,0 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,0 g Magie sulfat (MgSO4.H2O) 0,5 g Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin) Glycerol khan 0,002 g 220 g từ 12 g đến 15 ga Thạch Chloramphenicol 0,1 g Nước cất nước loại ion a 000 ml Tùy vào sức đông thạch  Vai trò thành phần môi trường Sản phẩm thủy phân mô động vật thực vật enzyme chứa phong phú chất đạm hữu cơ, cũng có số vitamin đường cung cấp chất dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển D-Glucoza (C6H12O6) nguồn vật chất cung cấp C trình sinh trưởng vi sinh vật Trong tế bào nguồn C trải qua loạt trình biến hoá hoá học phức tạp biến thành vật chất thân tế bào sản phẩm trao đổi chất Ngoài ra, nguồn C nguồn cung cấp lượng tốt cho vi sinh vật Kali dihydro phosphat (KH2PO4) : thành phần acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP… Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường Magie sulfat (MgSO4.H2O): thành phần trung tâm hoạt tính số emzyme, thành phần sắc tố quang hợp Môi trường có chứa dichloran rose bengal nên ức chế kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh , cho phép phát nấm mốc mọc chậm − Rose bengal chất dễ bị phân hủy ánh sáng, nên cần giữ môi trường − tối Glycerol khan có vai trò khử độc cho môi trường Với phương pháp bảo quản lạnh sâu, tế bào bị vỡ trình làm lạnh làm tan mẫu Để khắc phục nhược điểm người ta bổ sung Glycerol làm hạn chế tốc độ lạnh sâu làm tan nhanh Thạch dùng để làm rắn môi trường chất dinh dưỡng cho vi sinh vật sử dụng Cloramphenicol kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn, diệt khuẩn nồng độ cao vi khuẩn nhạy cảm cao Nước thành phần thiếu môi trường nuôi cấy, yếu tố quan trọng định phát triển sinh vật Sự trao đổi chất, trình sinh tổng hợp cấu trúc tế bào, nghĩa phản ứng sinh hóa xảy môi trường nước môi trường nước hoạt động dinh dưỡng bị dừng lại, trạng thái khô chất dinh dưỡng thâm nhập vào tế bào 2.1.3.2.3 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Yêu cầu chung Hòa thành phần vào nước cách đun sôi để hòa tan, trừ chloramphenicol Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 5,6 ± 0,2 250C, cần Cho thêm 10 ml dung dịch chloramphenicol 1% (nồng độ khối lượng) etanol trộn Phân phối môi trường vào vật chứa có dung tích thích hợp Khử trùng 15 hấp áp lực 1210C Làm nguội môi trường nồi cách thủy trì nhiệt độ từ 44 0C đến 470C Làm nguội đến 500C phân phối lượng 15 ml vào đĩa Petri vô trùng Để yên cho môi trường đông đặc làm khô bề mặt thạch theo TCVN 6404 (ISO 7218) TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất phần), cần Sử dụng bảo quản nơi tối thiểu TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất phần) sử dụng => CẢNH BÁO - Không để môi trường tiếp xúc với ánh sáng, tiếp xúc với ánh sáng sinh sản phẩm gây độc cho tế bào làm ảnh hưởng đến kết định lượng 2.1.4 Thực hành Cân 10g/25g mẫu rắn hút 10ml/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Pepton Water Đồng mẫu máy Stomacher 60 giây Pha loãng Dịch mẫu [ 10-1] 0.1 ml DRBC DG18 0.1 ml Dịch mẫu [ 10-2] 0.1 ml DRBC DG18 DRBC DG18 0.1 ml DRBC DG18 Dàn dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch que dàn mẫu vô trùng khô bề mặt thạch Ủ 250C/3-5 ngày Đọc kết Chọn đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc/mầm/chồi hai độ pha loãng liên tiếp Tính biểu thị kết 2.1.4.1 Các bước tiến hành Bước Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Mục đích: chuẩn bị mẫu cho giai đoạn trình phân tích thực xác hơn, chuyển vi sinh vật mẫu ban đầu vào dung dịch pha loãng, đồng mẫu, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển, không nhằm mục đích tăng sinh Cân xác 10g/25g mẫu rắn đong mẫu với thể tích 10ml/25ml mẫu lỏng phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ±5%, cho vào túi nhựa vô trùng ( bình tam giác ) Cho dung dịch pha loãng SPW 90/225ml (sai số cho phép ±5%) vô trùng vào túi nhựa ( bình tam giác ) chứa mẫu SPW tạo môi trường đẳng trương không làm tổn thương vi sinh vật Đồng mẫu dung dịch pha loãng SPW máy dập mẫu phút lắc bình tam giác có mẫu dung dịch pha loãng 2÷3 phút Việc giúp 10 phóng thích vi sinh vật mẫu bên trộn với dung dịch pha loãng mẫu, để bước phân tích xác Để vi sinh vật không bị tổn thương thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ dịch pha loãng suốt trình thao tác phải giữ xấp xỉ nhiệt độ phòng Do bào tử lắng xuống nhanh pipet, nên để pipet tư nằm ngang (không để đứng) làm đầy với thể tích huyền phù dung dịch pha loãng thích hợp Lắc huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng máy vortex để tránh phần tử có vi sinh vật lắng xuống Bước Pha loãng mẫu Mục đích: dung dịch sau pha loãng có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng phân lập vi sinh vật thành khuẩn lạc riêng biệt Từ gián tiếp xác định mật độ tế bào hay bào tử có thực phẩm cũng phân lập để tạo dòng vi sinh vật Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng nhiệt độ thích hợp Trộn kỹ máy vortex 5-10 giây để thu dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với loại mẫu làm từ nguyên chất thu dung dịch pha loãng 10 -1) Nếu cần, lặp lại thao tác để có dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5 ,… thu lượng vi khuẩn thích hợp Bước Cấy ủ mẫu Cấy: thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường sống sang môi trường thuận lợi cho phát triển chúng Ủ mẫu: trình đảm bảo trì điều kiện thuận lợi cho hoạt động phát triển vi sinh vật Mục đích: − − − − Phát có mặt vi sinh vật nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu Tiến hành nhân giống vi sinh vật cách nhanh chóng Bảo tồn giống khiết Nghiên cứu đặc tính sinh học hệ thống sinh học chúng 11 Dùng pipet vô trùng chuyển 0.1 ml mẫu thử lỏng 0.1 ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác cho vào đĩa thạch DRBC DG18 Dùng pipet vô trùng để chuyển 0.1ml dung dịch pha loãng thập phân thứ (10-1) ( sản phẩm dạng lỏng) 0.1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10 -2 ( sản phẩm dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC DG18 thứ hai Để thuận cho việc định lượng lượng nhỏ nấm men nấm mốc, lấy lượng đến 0.3ml dung dịch pha loãng 10-1 mẫu mẫu thử dạng lỏng, dàn ba đĩa Lặp lại thao tác với dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô trùng cho dung dịch pha loãng Dàn dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa que dàn mẫu vô trùng dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường Có thể sử dụng kỹ thuật cấy phương pháp đổ đĩa trường hợp tương đương kết phải đánh giá cách so sánh với kết cấy bề mặt đĩa Phương pháp cấy bề mặt cho kết định lượng cao Kỹ thuật dàn đĩa tạo điều kiện cho tế bào tiếp xúc tối đa với oxi không khí tránh nguy bị bất hoạt nhiệt chồi nấm Các kết phụ thuộc vào loại nấm Ủ đĩa chuẩn bị môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thảng đứng tủ ấm 25±10C 3-5 ngày Khuyến cáo ủ đĩa túi chất dẻo để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trường hợp nấm mốc lan đĩa Bước Đếm chọn lọc khuần lạc để khẳng định Mục đích: chọn lọc loại vi sinh vật cần định lượng để đếm, thu thập số liệu để tính toán Đếm đĩa khoảng thời gian ủ từ 3-5 ngày Chọn đĩa chứa 150 khuẩn lạc đếm chúng Nếu đĩa có nấm mọc nhanh đếm khuẩn lạc sau ủ ngày đếm lại sau ủ ngày Tiến hành kiểm tra kính hiển vi để phân biệt tế bào nấm men nấm mốc vi khuẩn từ lạc khuẩn, cần Đếm khuẩn lạc nấm men nấm mốc riêng rẽ, cần 12 Để nhận biết nấm men nấm mốc, chọn vùng phát triển nấm lấy để kiểm tra kính hiển vi cấy môi trường phân lập nhận dạng thích hợp 2.1.4.2 Kết 2.1.4.3 Tính toán kết Tổng số nấm men nấm mốc 1g mẫu (X) tính theo công thức X= (CFU/g hay CFU/ml) C: tổng số khuẩn lạc nấm men nấm mốc đếm đĩa độ pha loãng liên tiếp V: thể tích dịch cấy đĩa, tính mililit n1: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ n2: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ d: Hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ Làm tròn số kết có tới số có nghĩa ( chẳng hạn 2864 làm tròn 2900) biểu thị theo công thức: a x 10n a: số thập phân tương ứng có giá trị từ 1.0 đến 9.9 n: số mũ phù hợp 10 2.1.4.4 Biểu thị kết Ví dụ cách tính tổng nấm men, nấm mốc: Độ pha loãng 10-2 10-3 Số khuẩn lạc 83 13 97 Số khuẩn lạc nấm men nấm mốc đếm hai độ pha loãng liên tiếp là: − − Ở độ pha loãng d=10-2: đếm 83 khuẩn lạc 97 khuẩn lạc Ở độ pha loãng d=10-3: đếm 13 khuẩn lạc khuẩn lạc, ta có X= ƸC V*(n1 + 0,1*n2)*d = 83 + 97 + 13 0,1*(2+0,1*2)*10 = -2 91363 13 Làm tròn kết 9.1 x 104 CFU/g 2.2 Phương pháp 2: phân lập nấm men, nấm mốc ưa khô Phân lập nấm men, nấm mốc chịu thẩm thấu (osmophilic) phát triển nồng độ đường cao Để có gốc giống cần phải điều chỉnh hoạt độ nước (aw) việc pha loãng (diluent) môi trường phân lập nước pha loãng có 50% (W/w) glucose Môi trường thạch chứa 35-60% glucose cho phép tìm lại gốc giống chịu khô hanh (xerotolerant strains) không xảy phát triển điều kiện loại trừ gốc giống hư hỏng tiềm tàng mặt hàng có lượng đường cao mứt kẹo, a w môi trường giảm đòi hỏi ủ ấm kéo dài nhiều tuần Cách làm Chuẩn bị mẫu đồng 10-1 loạt mấu thực phẩm pha loãng dung dịch glucose 50% (W/W) Một ước số phù hợp mẫu đồng pha loãng trải bề mặt cao nấm men, mạch nha 40% (W/W) thạch glucose Ủ ấm đĩa nuôi nấm mốc 20-250C đĩa nuôi nấm men 25-300C, mấm men phải tới tuần Đếm khóm nấm men nấm mốc tính toán ước lượng gam 2.3 Phương pháp 3: Đếm nấm men nấm mốc phương pháp màng khô hoàn nước (Phương pháp Petrifilm TM) 2.3.1 Nguyên tắc Phương pháp sử dụng đĩa cấy chứa môi trường khô bổ sung kháng sinh, thuốc nhuộm để tăng khả quan sát phát triển chất tạo đông tan nước lạnh Các dung dịch huyền phù chưa pha loãng pha loãng cho vào đĩa với lượng ml/đĩa Dàn dung dịch huyền phù diện tích khoảng 30 cm2 Có thể dùng chất tạo đông để làm đông đặc đĩa, ủ ấm đếm nấm men nấm mốc 2.3.2 Thuốc thử Trong trình phân tích, sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước cất nước có chất lượng tương đương, trừ có qui định khác − Nước pha loãng, dung dịch nước đệm phosphat 14 − − − − − Kali dihydro phosphat (KH2PO4) Natri hydroxit (NaOH), dung dịch M (40 g/L) Dung dịch clotetraxyclin Dung dịch cloramphenicol Chất tạo đông tan nước lạnh 2.3.3 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường thiết bị, dụng cụ sau đây: − − Đĩa đếm nấm men nấm mốc Que dàn mẫu chất dẻo, để dàn huyền phù lên khắp vùng phát triển − − đĩa Pipet, dùng cho huyết học pipet dạng xylanh phân phối 1,0 ml Dụng cụ đếm khuẩn lạc, loại chuẩn loại có độ khuếch đại tương đương 1,5 lần − Bộ trộn: Bộ trộn có tốc độ cao từ 10 000 vòng/min đến 12 000 vòng/min − − loại túi nhu động Binh định mức 1l Nồi hấp áp lực 2.3.4 Cách tiến hành Đặt đĩa đếm nấm men nấm mốc lên bề mặt mặt pbẳng Nhấc màng mỏng phía ra, giữ pipet vuông góc với đĩa cấy cẩn thận ml huyến phù thử nghiệm vào mảng mỏng Đậy màng mòng phía xuống chất cấy Dùng tay nhấc que dàn mẫu chất dẻo Dóng thẩng tâm que dán mẫu với tâm dĩa Dàn huyền phù cách ấn nhẹ que dàn mẫu xuống tâm đĩa Không gạt que dàn mẫu từ bên sang bẽn màng mỏng Lấy que dàn mẫu để yên đĩa cho đông đặc lại Đặt đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang, hướng lên trên, không chồng cao 20 đĩa Ủ đĩa năm ngày nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C Đếm đĩa sau giai đoạn ủ Các khuẩn lạc nhỏ có màu xanh lục trắng nhạt nấm men Các khuẩn lạc nấm mốc thường có màu xanh cũng có sắc tố tự nhiên chúng (ví dụ: màu đen, vàng, xanh lục), chúng có khuynh hướng lớn khuếch tán nhiều so với khuẩn lạc nấm men 15 Để tính số nấm men nấm mốc, nhân số lượng tổng số nấm men nấm mốc/đĩa (hoặc số lương trung bình khuẩn lạc/đĩa, đếm đĩa kép độ pha loãng) với hệ số pha loãng tương ứng Khi đếm khuẩn lạc đĩa kép độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình khuẩn lạc cho độ pha loãng trước xác định trung bình số đếm nấm men nấm môc Các số đếm ước tính thực đĩa có nhiều 150 khuẩn lạc phải ghi số ước tính Trong việc đếm thế, xác định số đếm trung bình/1 cm2 nhân với 30 (diện tích phát triển khoảng 30 cm2) Với số lượng lớn khuẩn lạc nấm men làm cho toàn diện tích phát triển trở thành màu xanh Với số lượng lớn khuẩn lạc nấm mốc làm cho toàn diện tích phát triển trở thành màu xanh, màu đen, màu vàng Khi đó, có số đếm ước tính, pha loãng tiếp đổ đĩa huyền phù thử nghiệm để thu số đếm xác Tài liệu tham khảo Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM, Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Trần Linh Thước, Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước, Thực Phẩm Và Mỹ Phẩm Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức, Nguyễn Văn Dịp, Vi sinh vật thực Phẩm, kỹ thuật kiểm tra tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 7852:2008, Đếm nấm men nấm mốc phương pháp màng khô hoàn nước ( Phương pháp Petrifilmtm) 16